山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）是蔷薇科山楂属果实，又名山里果、山里红，是中国特有食药两用的树种[1]。其药用历史已有两千多年，可以抗氧化、降低血脂血糖[2-4]，也是健脾开胃、消食化滞的良药，对胸膈脾满、疝气等也有好的疗效[5-8]。
多酚是在植物性食物中发现的，别称为植物单宁，它的抗氧化功能可以对慢性病起到预防效果。一般存在于一些常见的植物性食物中，如可可豆、茶、蔬菜和水果，在山楂中也能提取到[9-10]。李启彭等[11]在用超声波法提取的山楂果肉中多酚含量为19.741 mg/g，果皮中多酚含量为67.148 5 mg/g，试验结果表明，在12种水果中，山楂的多酚含量最多，且果皮的多酚含量高于果肉。柳伟等[12]在用超声波法测定12种种皮多酚的研究中得出山楂皮中的多酚含量最多，为44.83mg/g。闪式提取根据组织破碎提取原理，其一次提取常在数秒至几分钟即可完成，适用于酶、多酚类等稳定性差的成分。王明华等[13]认为闪式提取法可将细胞完全打破，更有利于提取。
该试验旨在利用闪式提取法快的特点来提取测定山楂果肉中的多酚的含量，探讨提取时间、料液比、电压这些条件对提取率的影响，依据其性质，在单因素提取条件基础上，采用响应面优化设计考察几个关键因素在闪式提取中对多酚得率的影响，筛选出山楂多酚的最佳提取条件，为今后对山楂活性成分的提取及功能的深入研究奠定基础，对于提高山楂的经济价值、拉长山楂产业链有重要的意义[14-15]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
山楂：市售。没食子酸标准品（纯度≥98%）、福林酚、无水乙醇（分析纯）：生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.2 仪器与设备
JHBE-50T中草药闪式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；SBZ-019中草药粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；GZX-9023MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；7200-型分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；ZF-20L抽滤真空泵：郑州市亚荣仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理
将山楂洗净，然后人工去核，将去过核的山楂果肉置于60 ℃烘箱中烘干至质量恒定，用粉碎机粉碎，过80目筛，保存备用。
1.3.2 标准曲线的绘制
分别精密吸取没食子酸标准品母液0、0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL于6个10 mL的容量瓶中，用体积分数60%的乙醇溶液定容，得到质量浓度分别为0、0.024 mg/mL、0.048 mg/mL、0.072 mg/mL、0.096 mg/mL、0.120 mg/mL的没食子酸待测液，用移液枪吸取6个容量瓶中的待测液0.2 mL于6个试管中，再分别加入1 mL 10%福林酚显色剂，5 min后加入3 mL饱和Na2CO3溶液，振荡摇匀，使其在室温条件下黑暗反应1 h，于波长765 nm处测定吸光度值。以没食子酸质量浓度（X）为横坐标，吸光度值（Y）为纵坐标绘制标准曲线。没食子酸标准曲线为Y=4.113 1X+0.026 4（R2=0.991 4），线性关系良好。
1.3.3 多酚闪式提取工艺优化单因素试验
料液比的确定：称取1 g山楂粉于5个试剂瓶中，按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）加入体积分数60%的乙醇溶液于试剂瓶中，摇匀，室温（25 ℃）条件下用闪式提取器在提取电压100 V条件下提取60 s，5 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液于10 mL容量瓶中，体积分数60%的乙醇定容。分别从容量瓶中吸取0.2 mL溶液，后续步骤同1.3.2，以体积分数60%的乙醇溶液作为空白对照[16]。同理，依次考察提取时间（60 s、70 s、80 s、90 s、100 s）、提取电压（100 V、110 V、120 V、130 V、140 V）对多酚得率的影响。
1.3.4 响应面试验设计[17]
在单因素试验的基础上，利用Box-Benhnken原理，选取料液比（A）、提取时间（B）和提取电压（C）3个因素，以多酚得率（E）为响应值，采用3因素3水平的响应面分析方法进行试验设计，以获得最佳的提取条件[18]。响应面试验因素与水平见表1。
表1 山楂果肉中多酚闪式提取工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for flash extraction process optimization of polyphenols from hawthorn pulp
1.3.5 多酚得率的测定方法[19]
吸取0.2 mL已制备好的多酚提取液，采用和标曲制作相同的方法测定样品吸光度值A；求山楂粉末中多酚的质量浓度C；山楂多酚得率计算公式如下：
式中；E为山楂多酚得率，mg/g；C为多酚质量浓度，mg/mL；V为样液体积，mL；M为山楂粉末质量，g。
1.3.6 数据处理
使用DesignExpert8.0软件处理与分析响应面试验数据。
2 结果与分析
2.1 多酚闪式提取工艺优化单因素试验结果
2.1.1 料液比对山楂果肉中多酚得率的影响
图1 料液比对山楂果肉中多酚得率的影响
Fig.1 Effect of material to liquid ratio on polyphenols yield from hawthorn pulp
由图1可知，随着料液比的不断增加，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趋势，料液比为1∶40（g∶mL）时，多酚得率最高为36.33 mg/g。其原因可能是提取时的液体较多，浓度相对减小，导致刀片与山楂的剪切率下降，使山楂中多酚的有效成分提取不完全，也可能是其他物质的溶出而抑制了多酚的提取。由此确定，1∶40（g∶mL）是提取多酚的最佳料液比。
2.1.2 提取时间对山楂果肉中多酚得率的影响
图2 提取时间对山楂果肉中多酚得率的影响
Fig.2 Effect of extraction time on polyphenols yield from hawthorn pulp
由图2可知，随着提取时间的不断延长，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趋势，提取时间为80 s山楂样品溶液的多酚得率达到最大，为35.27 mg/g，继续增加提取时间后多酚得率逐渐下降，分析原因可能在提取的过程中刀头不断剪切，产生较多热量，继而随着提取时间的延长，溶液温度升高很快，不稳定的化学成分易发生变化[10]，由此确定80 s为最佳提取时间。
2.1.3 提取电压对山楂果肉中多酚得率的影响
图3 提取电压对山楂果肉中多酚得率的影响
Fig.3 Effect of extraction voltage on polyphenols yield from hawthorn pulp
由图3可知，随着提取电压的不断升高，山楂果肉中的多酚得率呈先上升后下降的趋势，当闪式提取电压达到110 V时，多酚得率最大，为34.92 mg/g，这可能是由于在高速电机的带动下，内外刀在高速旋转的过程中影响了某一部分多酚的内部结构，导致得率减少。因此，山楂在该条件下最佳提取电压为110 V。
2.2 响应面试验设计结果[20-22]
响应面试验设计及结果见表2。
表2 山楂果肉中多酚闪式提取工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface tests for flash extraction process optimization of polyphenols from hawthorn pulp
续表
通过统计分析软件Design-Expert 8.0进行数据分析，建立二次响应面模型为：E=42.72+0.76A-0.91B+1.39C-2.38AB-1.89AC+0.037BC-4.11A2-6.14B2-3.43C2。回归分析与方差分析结果及交互作用的响应面分析结果分别见表3和图5。
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
由表3可知，模型的F值为107.76（P＜0.000 1），说明整体模型差异极显著。一次项A、B、C，二次项A2、B2、C2对山楂样液的多酚得率影响极显著（P＜0.01），交互项AB、AC对山楂样液的多酚得率影响显著（P＜0.05），BC对其影响不显著（P＞0.05）。回归模型的决定系数R2=0.996 3，说明该模型可信度高，失拟项P＞0.05，不显著。这说明该模型与数据拟合程度较高，试验误差小，可用该模型分析和预测山楂多酚闪式提取的结果。
图5 料液比、提取时间、提取电压交互作用对山楂果肉多酚得率的影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between material to liquid ratio,extraction time and voltage on polyphenols yield from hawthorn pulp
由图5可知，料液比对多酚得率的影响较提取时间大。在一定范围内，料液比的提高有利于多酚向溶液中转移；料液比-提取电压交互作用的倾斜率较小，曲线较缓，两者的交互作用可以看出料液比比提取电压对多酚得率的影响更为显著；提取电压与提取时间的交互作用对多酚提取率的影响，可以看出提取电压比提取时间对多酚得率的影响更为显著。
2.3 验证试验
按照选定的条件，结合数学模型得到闪式提取的最佳条件为料液比1∶41（g∶mL）、提取电压112 V、提取时间79 s，模型预测多酚得率是42.91 mg/g。为验证该模型的准确性，在该条件下进行山楂多酚提取，重复试验3次，得到多酚得率均值为42.98 mg/g，此值接近于模型预测值，说明优化的提取工艺是合理的。
3 结论
本试验以山楂果肉为原料，利用闪式提取法和响应面分析法对多酚提取条件进行了优化，结果表明，最优闪式提取工艺为料液比1∶41（g∶mL）、提取时间79 s、提取电压112 V，在此条件下，山楂果肉的多酚得率为42.98 mg/g。
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