蛋乳发酵饮料是以新鲜鸡蛋、牛奶为主要原料通过杀菌、发酵等一系列加工工艺制成的一种色泽淡黄、风味独特、组织细腻、营养均衡的饮料[1]。鸡蛋消化率在95%以上，具有很高的营养价值[2-3]。牛奶营养丰富，是氨基酸、矿物质以及维生素的良好来源[4]。以鸡蛋全蛋液和脱脂牛乳为原料，经干酪乳杆菌发酵制成蛋乳发酵饮料可使营养更加均衡，更加容易被人体吸收。干酪乳杆菌可防止急性腹泻和食物过敏，具有良好的耐酸性及胆汁抗性，具有降低胆固醇的作用[5-7]，适合各种人群饮用。
国外关于蛋乳发酵饮料的研究比较早，LIN J C C等[8]分别利用全蛋液和蛋清液与牛奶发酵研制出鸡蛋酸酪乳，结果证明通过乳酸菌发酵蛋乳饮料开发一种新产品是可行的。20世纪80年代，日本研制出了发酵蛋黄乳饮料、发酵蛋清乳饮料以及发酵全蛋液乳饮料等各种花色发酵蛋乳饮料[9]。我国关于蛋乳发酵饮料研究主要集中在蛋液比例、糖原料、稳定剂配比、所选用的微生物菌种[10-15]。目前，以保加利亚乳杆菌（Lactobncillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）制备蛋乳发酵饮料的研究较多[16-19]，但市场上普通乳酸菌饮料不能满足人们需求。本研究以新鲜鸡蛋和脱脂牛乳粉为原料，采用干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）发酵一款新型蛋乳饮料，通过单因素试验和响应面试验，优化制备蛋乳发酵饮料工艺条件，并对蛋乳发酵饮料进行理化成分品质评价，旨在增加发酵乳花色饮料新品种，为鸡蛋的加工提供新的方法，也为蛋乳发酵饮料的工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜鸡蛋（兰州兴盛养殖场）：市售；脱脂牛乳粉：恒天然商贸责任有限公司；氢氧化钠、乙醇、石油醚、硼酸、氨水、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、酚酞、甲基红、次甲基蓝（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；MRS平板培养基：广东环凯微生物科技有限公司；干酪乳杆菌：从市售养乐多中分离纯化，本实验室保藏。
1.2 仪器与设备
TG16-WS台式高速离心机：中国长沙湘仪离心机仪器有限公司；SG2型酸度计：中国梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；DHG-9241A型电热恒温干燥箱：中国上海精宏实验设备有限公司；KND-04型自动凯氏定氮仪：中国上海纤检仪器有限公司；HOI-IB型数显恒温磁力搅拌器：中国上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；VS-840K超净工作台：中国苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-30SII高压蒸汽灭菌锅：中国西安常仪生化科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 蛋乳发酵饮料的制备工艺流程及操作要点
操作要点：
全蛋液灭菌：新鲜鸡蛋放入体积分数为75%酒精中浸泡10 min进行灭菌，打蛋后加入蔗糖搅匀，并将糖蛋液置于水浴锅中60 ℃、30 min巴氏杀菌。
脱脂牛乳灭菌：121 ℃灭菌20 min。
混合、冷却：60 ℃时将蛋乳液混合均匀，冷却至37 ℃。
调节pH：调节蛋乳液pH值为6.8。
接种：在MRS平板培养基中37 ℃厌氧培养48～72 h，之后挑取单个的干酪乳杆菌接入MRS液体培养基中37 ℃继续培养24～48 h，扩大培养至脱脂乳试管。按1%～5%的比例进行接种。
发酵：于37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h（pH值达到4.6）。
后熟：4 ℃冷藏12 h，即得蛋乳发酵饮料。
1.3.2 蛋乳发酵饮料发酵工艺优化单因素试验
研究发酵时间分别为12 h、15 h、18 h、21 h、24 h对蛋乳饮料感官评分、酸度、沉淀率的影响；蛋液添加量为2%、4%、6%、8%、10%对发酵蛋乳饮料感官评分、酸度、沉淀率的影响；脱脂奶粉添加量为2%、4%、6%、8%、10%对发酵蛋乳饮料感官评分、酸度、沉淀率的影响；接种量为1%、2%、3%、4%、5%对发酵蛋乳饮料感官评分、酸度、沉淀率的影响；蔗糖添加量为2%、4%、6%、8%、10%对发酵蛋乳饮料感官评分、酸度、沉淀率的影响。
1.3.3 响应面优化设计
在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken试验设计，以全蛋液添加量（A）、发酵时间（B）、干酪乳杆菌接种量（C）为影响因素，以感官评分（Y）为响应值设计3因素3水平响应面试验，Box-Benhnken试验设计因素与水平见表1。
表1 Box-Benhnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken tests design
1.3.4 感官评价方法
感官评价由实验室10位专业人员（5男5女）组成评定小组，按照表2的标准分别对色泽、香味滋味、组织状态、口感4个指标进行评分。在评定前对评定人员进行培训，取约50 mL蛋乳发酵饮料试样于无色透明的容器中，置于光亮处，迎光观察色泽和组织状态，并在室温条件下品尝滋味、嗅其气味[15]。采用描述性分析对发酵饮料的质地特性进行评价，满分100分。评分标准见表2[19]。
表2 蛋乳发酵饮料感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented egg-milk beverage
1.3.5 理化指标的测定
酸度：参照参考文献[20]的方法进行测定；稳定性：参照参考文献[21]的方法进行测定，其中沉淀率=沉淀物质量/10 mL蛋乳饮料质量×100%，沉淀率越大表明其稳定性越差；脂肪：参照参考文献[22]的方法进行测定；蛋白质：参照参考文献[23]的方法进行测定；pH值的测定：参照参考文献[24]的方法进行测定。
1.3.6 微生物指标的测定
乳酸菌活菌数测定方法参照国标GB 4789.3—2016《食品微生物学检验》的平板计数法[25-26]。
1.3.7 数据分析
试验数据采用Microsoft Excel 2010和统计软件SPSS 17.0数据系统进行统计与分析，同时用Duncan's法进行显著性分析。
2 结果与分析
2.1 蛋乳发酵饮料工艺优化单因素试验结果与分析
2.1.1 不同发酵时间对蛋乳发酵饮料品质的影响
由图1可知，发酵时间在12～24 h范围内，发酵蛋乳饮料的感官评分先增大后减小，当发酵时间为18 h时，感官评分达到最大值，为83.6分，沉淀率为0.176%，稳定性最高，酸度为73.6°T。当发酵时间在12～18 h时，干酪乳杆菌产酸量少，鸡蛋蛋腥味较重，甜度较大，组织状态稀疏；发酵时间＞18 h之后，酸味过重，掩盖了蛋乳的香味，糖酸比例失衡，组织状态粗糙，有颗粒状沉淀，影响口感。因此，选择最佳发酵时间为18 h。
图1 不同发酵时间对发酵蛋乳饮料品质的影响
Fig.1 Effect of different fermentation time on fermented egg-milk beverage quality
不同的字母表示存在显著性差异（P＜0.05），下同。
2.1.2 不同全蛋液添加量对蛋乳发酵饮料品质的影响
在蛋乳发酵饮料中，蛋液添加量多少直接影响发酵产品的口感和风味，蛋液含量少产品会缺乏特征风味；而蛋液含量多容易凝固。由图2可知，全蛋液添加量在2%～10%范围内，发酵蛋乳饮料的感官评分先增大后减小，蛋液添加量为6%时，感官评分达到最大值，为83.7分，沉淀率最小为0.302%，稳定性最高，酸度为73.7 °T。当蛋液添加量在2%～6%时，牛奶味掩盖住鸡蛋味，品尝不出鸡蛋的香味，破坏稳定结构，易产生沉淀；当蛋液添加量＞6%之后，蛋腥味过大导致感官评分下降。因此，选择最佳蛋液添加量为6%。
图2 不同全蛋液添加量对发酵蛋乳饮料品质的影响
Fig.2 Effect of different whole egg liquid additions on fermented egg-milk beverage quality
2.1.3 不同脱脂奶粉添加量对蛋乳发酵饮料品质的影响
图3 不同脱脂奶粉添加量对发酵蛋乳饮料品质的影响
Fig.3 Effect of different skimmed milk additions on fermented egg-milk beverage quality
由图3可知，脱脂奶粉添加量在6%时，感官评分达到最大值，为77.7分，沉淀率最小为0.163%，稳定性最高，酸度为52.3°T。脱脂奶粉的添加量对酸度影响较小。当脱脂奶粉添加量为2%～6%时，鸡蛋腥味较重，当脱脂奶粉添加量＞6%之后，又因为易产生沉淀，蛋味过轻，导致感官评分下降。因此，选择最佳脱脂奶粉添加量为6%。
2.1.4 不同接种量对蛋乳发酵饮料品质的影响
由图4可知，接种量在1%～5%范围内，发酵蛋乳饮料的感官评分先增大后减小。沉淀率先减小后增大。接种量在3%时，感官评分达到最大值，为83.1分，沉淀率最小为0.151%，稳定性最高，酸度为69.3 °T。接种量为1%～3%时，发酵产酸的速度快，易产生沉淀，口感差，产品组织状态差，因此评分较低。当接种量＞3%之后，接种量偏大，导致发酵饮料酸味过重，掩盖住牛奶和鸡蛋香味，糖酸比例失衡，形成小颗粒凝乳，影响口感，最终导致评分下降。因此，选择最佳接种量为3%。
图4 不同接种量对发酵蛋乳饮料品质的影响
Fig.4 Effects of different inoculum on fermented egg-milk beverage quality
2.1.5 不同蔗糖添加量对蛋乳发酵饮料品质的影响
由图5可知，蔗糖添加量在2%～10%范围内，蔗糖添加量为6%时，感官评分达到最大值，为81.4分，沉淀率最小为0.221%，稳定性达到最高，酸度为98.6°T。当蔗糖添加量＜6%之前，甜度较低，发酵完成后酸味过重，破坏产品稳定结构易产生沉淀，且掩盖住鸡蛋和牛奶的风味。当蔗糖添加量＞6%之后，稳定性差，感官评分下降。因此，选择最佳蔗糖添加量为6%。
图5 不同蔗糖添加量对发酵蛋乳饮料品质的影响
Fig.5 Effects of different sucrose addition on fermented egg-milk beverage quality
2.2 蛋乳发酵饮料工艺优化响应面试验结果与分析
在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken试验设计，以全蛋液添加量（A）、发酵时间（B）、干酪乳杆菌接种量（C）为影响因素（通过单因素试验蔗糖添加量与脱脂奶粉添加量对感官评分无显著影响故舍去），以感官评分（Y）为响应值设计3因素3水平响应面试验，Box-Benhnken试验设计与结果见表3，方差分析见表4。
根据表3试验结果建立模型，采用逐步回归的方法对数据进行二次多项回归分析，得到关于感官评分对全蛋液添加量、发酵时间以及接种量的二次回归方程：Y=73.46+2.50A-2.40B-5.05C+3.67AB+2.08AC+0.43BC-5.84A2-7.84B2-5.09C2
由表4可知，回归模型的F值为14.08，P＜0.01，差异极显著；失拟项F值为2.87，P=0.167 4＞0.05，失拟项差异不显著，即模型拟合程度较好，进一步说明模型变异程度较小。通过数据进行方差分析发现该模型的决定系数R2=0.947 7，变异系数为4.22%，模型变异较小。一次项A、B、交互项AB对结果影响显著（P＜0.05）；一次项C、二次项A2、B2、C2对结果影响显著（P＜0.01）。综上所得，该模型能对蛋乳发酵饮料工艺进行分析和优化模拟。
表3 Box-Benhnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Benhnken tests
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
蛋液添加量（A）、发酵时间（B）和接种量（C）3个因素的交互作用的响应面及等高线见图6。
图6 全蛋液添加量、发酵时间及接种量对蛋乳发酵饮料感官评价影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between whole egg liquid addition,fermentation time and inoculum on sensory evaluation of fermented egg milk-beverage
由图6A可知，从其椭圆形图可以直观的看出随着全蛋液添加量的提高，感官评分先上升后下降，随着发酵时间的增加，感官评分也是先上升后下降，等高线图呈椭圆形，由回归分析可知全蛋液添加量和发酵时间的交互作用显著。由曲面坡度的陡峭情况可知，全蛋液添加量的曲面比发酵时间的曲面更陡，说明全蛋液添加量对感官得分影响更加显著。
由图6B可知，从其椭圆形图可以直观的看出随着全蛋液添加量的提高，感官评分先上升后下降，随着接种量的增加，感官评分也是先上升后下降，等高线图呈椭圆形。由回归分析可知全蛋液添加量和接种量的协同作用不显著。由曲面坡度的陡峭情况可知，接种量的曲面比全蛋液添加量的曲面更陡，说明接种量对感官得分影响更加显著。
由图6C可知，从其椭圆形图可以直观的看出随着发酵时间的增加，感官评分先上升后下降，随着接种量的增加，感官评分呈先上升后下降的趋势。等高线图呈椭圆形，由回归分析可知发酵时间和接种量的协同作用不显著。由曲面坡度的陡峭情况可知，接种量的曲面比发酵时间的曲面更陡，说明接种量对感官得分影响更加显著。
2.3 验证试验
通过响应面软件对试验数据的分析，得到最佳工艺条件为发酵时间17 h、接种量2.02%、全蛋液添加量6.32%。为方便实际操作，修改工艺条件为发酵时间17 h、接种量2%、全蛋液添加量6%，在此优化条件下进行3次验证试验，感官评分实际值为91.6分，与理论值90.36分接近，说明采用响应面优化的生产工艺参数准确可靠，按照建立的模型进行试验在实践中是可行的。
2.4 蛋乳发酵饮料产品的质量指标
表5 蛋乳发酵饮料的质量指标
Table 5 Quality indexes of fermented egg-milk beverage
由表5可知，此条件下的蛋乳发酵饮料感官上具有特殊的发酵香味和酸味，无蛋腥味，呈均匀乳黄色有光泽的乳饮料。经测定发酵蛋乳饮料中蛋白质含量为3.40%、脂肪含量为1.60%、酸度为70°T。乳酸菌活菌总数＞106CFU/mL。结果表明，感官指标、理化指标及微生物指标均满足GB/T 21732—2008《含乳饮料》中相关指标要求[27]。
3 结论
通过单因素试验和响应面试验确定蛋乳发酵饮料的最佳工艺条件为：发酵时间17 h，全蛋液添加量6.3%、接种量2.0%，在此优化工艺条件下，蛋乳发酵饮料感官评分为91.6分，颜色均匀呈淡黄色，组织细腻，有发酵饮料特有的发酵香味和滋味。蛋白质含量为3.40%、脂肪含量1.60%、酸度为70°T、pH值为4.45，乳酸菌活菌数＞106 CFU/mL，蛋乳发酵饮料营养均衡、风味独特，有较好的研究价值和发展前景。
[1]马美湖，潘彬.鸡蛋酸奶研制的总结介绍[C].中国蛋品科技大会，2004.
[2]LOMAKINA K,MIKOVA K.A study of the factors affecting the foaming properties of egg white-a review[J].Czech J Food Sci,2006,24(3):110-118.
[3]常珠侠，王宇建.蛋乳发酵工艺的研究[J].化工时刊，2007，21（5）：49-50.
[4]KALANTZOPOULOS G.Fermented products with probiotic qualities[J].Anaerobe,1997,3(2-3):185-190.
[5]孟岳成，张婧，金娜.干酪乳杆菌发酵乳饮料的研制及其稳定性研究[J].食品科技，2010，35（12）：68-71.
[6]张杰，郗宏波，苏贺靖，等.干酪乳杆菌发酵酸乳生产工艺优化[J].食品研究与开发，2013，34（7）：88-91.
[7]吕玉珍，张爽，卞勇，等.鸡蛋酸乳制品的研制[J].金陵科技学院学报，2011，27（1）：86-92.
[8]LIN J C C,CUNNINGHAM F E.Preparation of a yogurt-like product containing egg white[J].J Food Sci,2010,49(6):1444-1448.
[9]房兴堂.鸡蛋乳酸菌发酵饮料的研制[J].科技创业月刊，1998（9）：16-17.
[10]高倩倩.发酵鸡蛋乳饮料工艺研究[J].现代营销（学苑版），2010（8）：56-57.
[11]张晶，张红星，谢远红，等.藏灵菇源酵母菌和乳酸菌降胆固醇蛋乳发酵饮料的研制[J].中国酿造，2013，32（9）：50-53.
[12]陈大鹏，李春荣.鸡蛋酸乳的工艺及风味的研究[J].食品工业，2012，33（7）：33-35.
[13]石飞云，刘树兴，但俊峰，等.发酵蛋乳饮料的工艺研究[J].食品科技，2007，32（2）：196-198.
[14]闫金姣，李斌，杨凌霄，等.蛋乳发酵酸奶工艺的探讨[J].食品工业科技，2011，32（7）：474-477.
[15]张敏，张子豪，康建依，等.单一干酪乳杆菌KL1 发酵益生菌酸奶工艺条件的研究[J].食品工业科技，2017，38（21）：104-109.
[16]董涛，张国松，周玉玲.养乐多风味乳酸菌饮料生产工艺的探讨[J].中国乳品工业，2005，33（4）：40-41.
[17]郑伯红.番茄蛋乳活性乳酸菌饮料的工艺研究[D].雅安：四川农业大学，2014.
[18]李亚蕾，杨波，李文霞.草莓蛋乳乳酸菌饮料的工艺研究[J].食品工业科技，2008（6）：186-188.
[19]穆念慈，张爽，王晓芳，等.响应面法优化Kefir 菌群发酵蛋乳工艺[J].食品工业，2017，38（4）：162-166.
[20]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.239—2016食品安全国家标准食品酸度的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[21]麻成金，黄群，姚茂君，等.鹌鹑蛋发酵乳饮料生产工艺研究[J].食品科学，2009，30（24）：480-483.
[22]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5413.3—2016 食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[23]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.5—2016 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[24]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.237—2016 食品安全国家标准食品pH 值的测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[25]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 7101—2015 食品安全国家标准饮料[S].北京：中国标准出版社，2016.
[26]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.3—2016 食品安全国家标准食品微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2016.
[27]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB/T 21732—2008 含乳饮料[S].北京：中国标准出版社，2008.