青方腐乳又名青腐乳，俗称臭豆腐，是腐乳的一大类[1]。它是以大豆为主要原料，在后期发酵过程中，加低度盐水汤料酿制而成的表里颜色呈青色或豆青色的腐乳，其具有刺激性的臭味，但臭里透香[2-3]，最有名的是北京王致和臭豆腐。由于青方腐乳发酵后使一部分蛋白质的硫氢基和氨基游离出来产生了以硫化物气味为主的臭味，所以青方的风味很容易被感觉到[1，4]。与其他类型相比，青方腐乳蛋白质分解较彻底，氨基酸含量丰富，特别是青方腐乳中含有较多的丙氨酸，有独特的甜味和酯香味[1，3]。
青方腐乳作为一种富含蛋白质的佐餐制品，经长期发酵很容易产生生物胺。生物胺是一类含氮低分子质量化合物的总称[5]。有研究发现，生物胺广泛存在于各种食品中，尤其是富含蛋白质及氨基酸的强化食品和发酵食品，常见的主要有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺等[6]。微量生物胺是生物体内的正常生理成分，在机体中发挥着重要的作用。高浓度的生物胺不仅会影响食品风味甚至改变其成分[7]，人体一旦摄入过量的生物胺，尤其是多种生物胺同时摄入，会引起中毒、心悸、恶心、呼吸紊乱、高血压等症状，严重时还会危及生命[8-9]。有关生物胺的报道表明，组胺对人体健康影响最大，8～40 mg就会轻微中毒，超过100 mg就会产生严重中毒反应，甚至会出现休克。酪胺的毒性仅次于组胺，超过100 mg会出现偏头痛等症状[10-11]。目前，有关腐乳中生物胺的报道大部分集中在工艺条件对其含量的影响、产生物胺菌株的鉴定以及检测方法以及腐乳的功能性作用方面。而关于腐乳开盖后贮藏过程中生物胺的研究报道较少。QIUS等[12-13]研究了在腐乳成熟期添加乙醇对生物胺含量的影响，发现添加乙醇对实验室制得的腐乳生物胺总量有降低作用。TSAI Y H等[14]对台湾地区22个腐乳样品中组胺含量以及合成组胺的微生物进行了研究，发现枯草杆菌菌种可以合成组胺，但合成能力较低。刘振峰等[15]采用高效液相色谱法检测了中国传统发酵豆制品中的10种生物胺，发现不同样品的生物胺含量差异很大。食品中生物胺的测定分析方法主要有薄层色谱法[16]、气相色谱法[17]、离子色谱法[18]、毛细血管电泳法[19]和高效液相色谱法[20]等，其中高效液相色谱法检测灵敏度高，重现性好，是测定生物胺含量的有效方法。本实验青方腐乳生物胺的测定采用高效液相色谱法。
腐乳开盖后易受微生物污染，可能存在生物胺超标的风险。本试验选取了同一生产日期同一品牌的市售青方腐乳，研究开盖后贮藏在不同温度下其生物胺含量、水分活度（water activity，Aw）、pH、氨基酸态氮的动态变化，探讨生物胺与理化指标之间的相关性，以期为青方腐乳食用安全性提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
青方腐乳（同一生产日期同一品牌）：市售。
1.1.2 化学试剂
腐胺、色胺、组胺、苯乙胺、精胺、酪胺、尸胺和亚精胺标准品（纯度均＞97%）：美国Sigma-Aldrich试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：上海Merck试剂有限公司；丹磺酰氯（纯度≥98%）：上海麦克林试剂有限公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；丙酮、浓盐酸（37%）、氨水、碳酸氢钠、氢氧化钠、乙酸铵、甲醛（38%）、氯化钠（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
610L真空冷冻干燥机：新阳速冻设备制造有限公司；2695型高效液相色谱仪：美国Waters仪器有限公司；Eclipse XDB-C18液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国Agilent仪器有限公司；CP214电子分析天平：奥斯豪仪器上海有限公司；5424R高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；XHF-DY搅拌分离器：上海奥克斯仪器有限公司；QL-861涡旋机：海门市其林贝尔仪器制造有限公司；STARTER2100酸度计：宁波新芝生物科技有限公司；Novasina CH-8533水分活度测定仪：瑞士步琦有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理方法
将购买的8瓶青方腐乳开盖后分别在4 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃条件下各放两瓶，之后在0、15 d、30 d、45 d、60 d取样测定生物胺含量、水分活度、pH和氨基酸态氮含量等指标。
1.3.2 生物胺的测定
青方腐乳生物胺的测定采用高效液相色谱法，具体操作参照李大伟等[20]的方法。
1.3.3 理化指标的测定
（1）水分活度的测定
水分活度（Aw）用水分活度测定仪进行测定，具体操作如下：在温度18～25 ℃，相对湿度50%～80%的条件下，用饱和盐溶液校正水分活度仪，称取约1 g（精确至0.01 g）试样，迅速放入样品皿中，封闭测量仓，每隔5 min记录水分活度仪的响应值。当相邻两次响应值之差＜0.005时，即为Aw测定值。待仪器充分平衡后，同一样品重复测定3次。
（2）pH的测定
pH的测定参照刘振锋[21]的方法并作部分修改，称5.0 g样品于50 mL离心管中，加20 mL去离子水利用均质机分散均质，然后4 ℃、3 600×g条件下离心25 min，将上清液转移至50 mL容量瓶，用去离子水定容后取出40 mL，用pH计直接测量，每个样品重复检测3次。
（3）氨基酸态氮含量的测定
氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AAN）含量的测定参照行标SB/T 10170—2007《腐乳》[22]中的方法进行。
1.3.4 相关性分析
水分活度、pH、温度等可以通过影响微生物繁殖以及酶系的活性进而影响生物胺的合成。因此，理化指标与生物胺之间存在一定的联系。本实验将所得的生物胺含量和理化指标的数据做相关性分析，选择双变量，用Pearson相关系数以P值在0.05水平下具有统计学意义来确定。
1.3.5 数据处理
数据统计分析使用SPSS 22.0分析，数据方差分析（analysis of variance，ANOVA）及其差异显著性分析使用Duncan多重比较，绘图使用Origin8.6。
2 结果与分析
2.1 贮藏温度对青方腐乳生物胺的影响
温度对生物胺的产生有重要的影响，孟勇等[23]研究不同贮藏温度对中华绒螯蟹生物胺的影响时发现，温度越高，生物胺产生速度越快。青方腐乳开盖后在不同温度下贮藏时，生物胺的含量测定结果见表1。由表1可知，贮藏温度对不同生物胺的含量变化有不同影响。随开盖贮藏时间的延长，色胺、苯乙胺、腐胺和酪胺的变化规律类似，呈先升高后降低趋势，尸胺呈先升高后降低再升高的趋势。不同贮藏温度下，刚开盖的青方腐乳中未检测到精胺和亚精胺。刚开盖时，组胺含量均＜100 mg/kg，贮藏15 d时组胺含量均＞100 mg/kg，超过了美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）对水产中组胺的推荐限量值＜50 mg/kg[24]，有可能会出现中毒症状。青方腐乳酪胺含量在不同温度条件下贮藏至30 d（除25 ℃第30天）时，酪胺含量均＞100 mg/kg。贮藏前30 d，随着贮藏时间的延长，25 ℃和35 ℃贮藏的青方腐乳，苯乙胺含量比4 ℃和15 ℃的要高，说明苯乙胺形成的适宜温度在25～35 ℃。贮藏前中期（0～30 d）的组胺在25 ℃和35 ℃含量增长较快；贮藏后期（30～60 d）组胺含量降低。可能是由于微生物的污染导致pH的降低，抑制了酶的活性，也有可能是腐乳在贮藏后期水解的组氨酸含量降低。
表1 市售青方腐乳样品开盖后在不同温度下贮藏生物胺含量的变化
Table 1 Changes of biogenic amine contents of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid
注：“ND”表示未检出；同一列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
综上所述，从食用安全角度考虑，腐乳开盖后尽量在15 d之内食用完。从本次试验结果来看，即使在4 ℃贮藏的条件下，在第15天也可能存在组胺中毒的现象。
2.2 不同贮藏温度下理化指标的动态变化
2.2.1 不同温度下贮藏水分活度的动态变化
对不同温度贮藏的青腐乳水分活度变化进行测定，结果见图1。由图1可知，4 ℃贮藏的青方腐乳Aw呈先上升后下降在上升的趋势，15 ℃贮藏的青方腐乳Aw一直处于缓慢上升的趋势。在25 ℃和35℃贮藏的青方腐乳Aw的变化趋势相一致，都是先下降后上升在下降的趋势。在整个贮藏过程中，青腐乳4种不同贮藏温度条件下Aw均＞0.84，微生物能够生长繁殖，可能产生脱羧酶。
图1 市售青方腐乳样品开盖后不同温度下贮藏水分活度的变化
Fig.1 Changes of water activity of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid
2.2.2 不同温度下贮藏pH的动态变化
测定不同贮藏温度下的青方腐乳pH，结果见图2。由图2可知，15 ℃、25 ℃、35 ℃贮藏的开盖青方腐乳pH在整个贮藏期变化规律基本一致，且都在贮藏第15天pH达到最大值，说明不同贮藏温度对青方腐乳pH变化规律影响不大，青方腐乳贮藏15 d时pH达最大值，可能是由于微生物分泌蛋白酶的作用，将蛋白质降解为氨基酸，随后进一步脱氨基产生氨，导致pH 值明显上升，贮藏15 d后pH 值有下降趋势，可能是由于酸性氨基酸增加、有机酸产生等引起总酸含量升高。35 ℃贮藏的腐乳pH均高于25 ℃贮藏的腐乳，这与35 ℃贮藏的腐乳总胺含量高于25 ℃贮藏的腐乳相一致。腐乳贮藏过程中pH的动态变化，也侧面反应出腐乳生物胺的动态变化。受试青方腐乳的pH均在7.0～7.7之间，可能是青方腐乳中氨类含量较高，或是蛋白质过度水解使生物胺等碱类物质含量增加。
图2 市售青方腐乳样品开盖后不同贮藏温度下pH值的变化
Fig.2 Changes of pH value of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid
2.2.3 不同温度下贮藏氨基酸态氮的动态变化
不同温度下贮藏，青方腐乳氨基酸态氮的动态变化结果见图3。
由图3可知，4 ℃、15 ℃、25 ℃贮藏的青方腐乳开盖开始时AAN含量差异不显著，但在其整个贮藏过程中，AAN含量变化规律不同，4 ℃贮藏的青方腐乳AAN含量在整个贮藏过程中一直处于上升状态且在第60天达到最大值（0.54 g/100 g）；15 ℃贮藏的青方腐乳AAN含量先升高后降低再升高，在第30天达到最大值（0.537 g/100 g）；25 ℃贮藏的青方腐乳AAN含量在整个贮藏过程中变化规律和15 ℃贮藏的腐乳变化规律相一致，但在第60天达到最大值。在贮藏的前15 d，贮藏温度越高，氨基酸态氮增加越快。贮藏过程中AAN含量的变化一定程度上也可反映总胺含量的动态变化。
图3 市售青方腐乳样品开盖后不同温度贮藏条件下氨基酸态氮含量的变化
Fig.3 Changes of amino acid nitrogen contents of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid
2.3 生物胺与理化指标的相关性分析
生物胺与理化指标之间的相关性用SPSS 22.0进行分析，结果见表2。
表2 生物胺与理化指标的相关性
Table 2 Correlation between biological amines and physicochemical indicators
注：“*”表示0.05水平显著相关（双尾）；“**”表示0.01水平显著相关（双尾）。
由表2可知，pH值与苯乙胺、尸胺、组胺和亚精胺呈极显著正相关（P＜0.01）；水分活度与所测的8种生物胺无显著的相关性（P＞0.05）；腐胺与色胺、苯乙胺、尸胺、组胺、酪胺和精胺呈极显著正相关（P＜0.01）；色胺与苯乙胺、尸胺呈显著正相关（P＜0.05）。发酵食品中产生的瓜氨酸能在不同酶的作用下合成腐胺的前体物质精氨酸和鸟氨酸，而腐胺是精胺和亚精胺的前体物质；有文献报道，胍基丁胺的存在也能诱导微生物合成腐胺，而组胺和酪胺能影响胍基丁胺的合成，从而影响到腐胺的合成[25]，所以可能是不同的生物胺之间存在转化。
3 结论
通过研究贮藏温度对市售青方腐乳开盖后生物胺的影响，初步明确青方腐乳在四种温度下贮藏至第15天时，苯乙胺和组胺含量分别超过30 mg/kg和100 mg/kg（即FDA的推荐的限量值），可能会产生一定的安全风险。各种生物胺与理化指标存在一定的相关性，说明Aw、pH和氨基酸态氮的变化也可从侧面反映出总胺含量的动态变化。目前，我国对食品中生物胺的限量标准大部分是关于鱼类组胺的，腐乳中的生物胺含量还未有标准限定。就此试验结果来看，青方腐乳开盖后即使在4 ℃贮藏，在第15天也可能存在组胺和苯乙胺中毒的风险为了食用安全，腐乳开盖后应尽量在15 d内食用完。
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