柿子隶属柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.），与葡萄、香蕉、柑橘、苹果并称我国五大水果[1]。柿子中含有丰富的维生素C（vitamin C，VC），是葡萄中VC含量的10倍左右，柿子中单宁可以清除体内自由基，并抑制细胞的癌变。此外柿子中还含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、磷、钙、铁等丰富的营养物质。我国柿子种植面积、柿子产量均居世界首位。目前，我国对柿子的利用率较低，柿子主要以脱涩脆柿子、柿饼为主，还有一些柿醋、柿酒、柿汁、柿叶茶等[2]。以柿子为原料酿造的酒，酒精度低、营养价值高，有很好的保健功能，据测定，柿子果酒中氨基酸的含量约为36%[3]。
果酒中的甲醇主要来自于果胶水解、甘氨酸脱氨脱羧、甘氨酸脱羧亚硝酸化等，当人体摄入甲醇后，经代谢会产生甲醛和甲酸，甲酸在体内有累积作用，积累在眼睛处会破坏视觉神经细胞和脑神经细胞，产生永久性损害，最后致使失明，减少甲醇的方法主要有降低果胶的含量、提高酒精度。高级醇主要来自于降解代谢途径[4]，柿子因富含果胶，在酿造过程中易产生对人体健康危害极大的甲醇。柿子酒中的高级醇主要包括异丁醇、异戊醇和正己醇，一定量的高级醇使柿子酒口感更醇厚、丰满，协调性更强，高级醇的含量过高或过低都会影响酒的风味。饮用过量的高级醇后对人体健康有害[5]。
本研究以柿子为主要原料，研究去皮、蒸煮和添加果胶酶3种预处理对柿子酒发酵过程中还原糖、总酸、酒精度、甲醇以及高级醇的影响，旨在优化柿子酒的酿造工艺，为其深加工提供理论参考和实践指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
磨盘柿：2018年采摘于河北省保定市，采后放于4 ℃冷库储藏备用。
活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果胶酶与纤维素酶复配酶制剂（果胶酶（2.25×104U/g），纤维素酶（9×104U/g））：法国SAS SOFRALAB OENOFRANCE公司。
氢氧化钠、酒石酸钾钠、葡萄糖、浓盐酸、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、亚硫酸钠、氯化钠（均为分析纯）：天津天利化学试剂有限公司；甲醇、乙醇、异戊醇、异丁醇、正己醇（均为色谱纯）：美国蓝白Labscience公司。
1.2 仪器与设备
HH-4电热水浴锅：上海比朗仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；ID5002C电子天平：天津天马横基仪器有限公司；SPX型生化培养箱：上海东器实业有限公司；7890B气相色谱：美国Agilent有限公司；DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱：广东精华智能装备有限公司；DZTW电陶炉：上海科恒实业发展有限公司；PAL-α糖度计：日本爱拓公司。
1.3 实验方法
1.3.1 柿子酒酿造工艺流程
柿子→挑选→去柄→打浆→不同处理→加入酵母→发酵检测→澄清→过滤→成品[6]
1.3.2 酵母活化
将活性干酵母按照1∶10（g∶mL）的比例和2%葡萄糖水混合于小烧杯中，小心静置在36～38 ℃的恒温水浴锅中，每隔10 min轻轻摇晃一次，有丰富浓密的小气泡产生，即代表活化成功，时间在20～30 min为宜。
1.3.3 去皮对柿子酒发酵过程中理化指标、甲醇和高级醇的影响
称取4 000 g柿子，进行挑选、去柄，将挑选好的柿子分为两组，一组进行去皮处理，另一组不做去皮处理。将两组进行打浆，加入0.1%的果胶酶与纤维素酶复配剂在45 ℃水浴中处理3 h。将酿酒酵母进行活化，酵母活化同1.3.2，将活化好的酵母加入到处理好的柿子浆中，搅拌均匀，将两组柿子浆分装到5个发酵瓶中，每3个作为平行实验，在24 ℃恒温培养箱中发酵8 d，每隔1 d进行取样，将样品贮藏在-4 ℃冰箱中备用。
1.3.4 蒸煮对柿子酒发酵过程中理化指标、甲醇和高级醇的影响
称取4 000 g柿子，进行挑选、去柄、打浆，将柿子浆分为两组，一组将柿子浆煮15 min，另一组不做蒸煮处理。待柿子浆冷却，均加入0.1%的果胶酶与纤维素酶复配剂，在45 ℃水浴中处理3 h。将酿酒酵母进行活化，酵母活化同1.3.2，将活化好的酵母加入处理好的柿子浆中，搅拌均匀，将两组柿子浆分装到5个发酵瓶中，每3个作为平行实验，在24 ℃恒温培养箱中发酵8 d，每隔1 d进行取样，将样品贮藏在-4 ℃冰箱中备用。
1.3.5 测定方法
总酸：参考GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》进行测定。
酒精度：参照GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》进行测定。
还原糖：参照参考文献[7-8]的方法进行测定。
甲醇、高级醇：参照参考文献[9]的方法进行测定。
1.3.6 数据处理方法实验结果统计分析方法使用SPSS23.0软件进行统计分析，差异显著性水平为0.05，使用Origin9.0作图。
2 结果与分析
2.1 原料预处理方式对柿子酒发酵过程中理化指标的影响
2.1.1 去皮对柿子酒发酵过程中还原糖、总酸、酒精度的影响
去皮对柿子酒发酵过程中还原糖含量、总酸含量、酒精度的影响如图1所示。
由图1a可知，去皮处理与带皮处理柿子酒在发酵前的还原糖含量分别为14.86 g/L、16.22 g/L，发酵过程中两组柿子酒中还原糖含量随发酵时间延长而下降，当发酵到第2天时，带皮处理的柿子酒中还原糖含量明显低于去皮发酵，可能是因为可能是由于柿子皮上带有的微生物进行了生长代谢，与带皮发酵相比，去皮发酵过程中还原糖下降更为缓慢，发酵过程更易于控制。第8天发酵结束，去皮处理的柿子酒中还原糖含量（2.09 g/L）较带皮处理的柿子酒中还原糖含量（1.17 g/L）高44%，可能是因为带皮处理组发酵体系黏度较高，影响微生物对还原糖的利用[10]。
由图1b可知，去皮处理与带皮处理柿子酒在发酵前的总酸含量分别为0.79 g/kg、1.20 g/kg，发酵过程中两组柿子酒中总酸含量随发酵时间延长而升高，发酵结束后，去皮处理柿子酒中总酸含量（3.94 g/kg）、较带皮处理柿子酒中总酸含量（4.28 g/kg）低7.9%，可能是因为柿子皮中含有酸类物质[11]。
由图1c可知，去皮处理与带皮处理柿子酒在发酵前的酒精度含量分别为2.35%vol、2.05%vol，两组柿子酒的酒精度随发酵时间的延长而不断升高，发酵到第6天到达稳定，发酵终点两组柿子酒的酒精度分别为9.12%vol、9.03%vol，去皮处理组比带皮处理组略高，可能是由于柿子皮中带有微生物，与酵母菌形成竞争关系，去皮处理发酵液更加类似于清汁发酵，使微生物能更加充分的利用柿子中的营养物质[12]。
图1 去皮、带皮处理对柿子酒发酵过程中还原糖含量（a）、总酸含量（b）、酒精度（c）的影响
Fig.1 Effects of peeling and non-peeling treatment on reducing sugar content (a),total acid content (b),and alcohol content (c) in the fermentation process of persimmon wine
2.1.2 蒸煮对柿子酒发酵过程中理化指标的影响
蒸煮对柿子酒发酵过程中还原糖含量、总酸含量、酒精度的影响如图2所示。
由图2a可知，蒸煮处理与不蒸煮处理柿子酒在发酵前的还原糖含量分别为11.90 g/L、12.47 g/L，两组柿子酒的还原糖含量在发酵前期随着发酵的进行急剧下降，而在第4天趋于稳定，发酵终点还原糖含量均小于4 g/L。还原糖含量随着发酵时间的增加而减少主要是因为发酵前期酵母菌生长活跃，消耗了大量的还原糖，而到发酵后期酒精度不断升高，大量的酵母菌死亡，不再消耗还原糖，还原糖含量趋于稳定。发酵结束后蒸煮处理的柿子酒还原糖含量（3.26 g/L）较不蒸煮处理的柿子酒还原糖含量（2.09 g/L）高36%，可能是因为蒸煮过程中组织结构被严重破坏，有大量糖分流出[13]，或者蒸煮温度较高，使柿子中自身带的微生物死亡，减少了对还原糖的利用[14]。
由图2b可知，蒸煮处理与不蒸煮处理柿子酒在发酵前的总酸含量分别为1.12 g/kg、0.93 g/kg，两组柿子酒中总酸的含量随时间的延长总体呈先上升后下降的趋势，柿子酒中的酸主要来源有柿子中本身带有的酸和酵母代谢产生的有机酸，而总酸含量下降的是因为酸与其他物质发生了反应，如酸与醇反应生成酯[15]。在发酵前两天蒸煮处理的总酸含量比不蒸煮处理的总酸含量高，可能是因为经过蒸煮处理后，酸类物质流出来，而随着发酵过程的进行不蒸煮处理经过微生物生长代谢，总酸含量不断升高，发酵结束后蒸煮处理的柿子酒总酸含量（4.46 g/kg）较不蒸煮处理的柿子酒中总酸含量（4.93 g/kg）低9.5%。
由2c可知，蒸煮处理与不蒸煮处理柿子酒在发酵前的酒精度含量分别为1.5%vol、1.6%vol，两个处理酿造的柿子酒的酒精度随发酵时间的延长而不断升高，发酵到第6天到达稳定，发酵终点两个处理的酒精度分别为9.35%vol、9.15%vol，蒸煮处理略低于不蒸煮处理组，因为蒸煮后发酵体系中醋酸菌、乳酸菌被杀死[16-17]。
图2 蒸煮对柿子酒发酵过程中还原糖含量（a）、总酸含量（b）、酒精度（c）的影响
Fig.2 Effect of cooking on reducing sugar content (a),total acid content (b),and alcohol content (c) in the fermentation process of persimmon wine
2.2 原料预处理对柿子酒发酵过程中甲醇的影响
2.2.1 去皮对柿子酒发酵过程中甲醇的影响
由图3可知，两组柿子酒中甲醇含量随发酵时间的延长而减少，发酵结束时，去皮处理的柿子酒中甲醇含量（62.88 g/mL）较带皮处理的柿子酒中甲醇含量（77.68 g/mL）低19%。可能是因为柿子皮中果胶含量较高，去皮处理后大大减少了果胶含量，从而减少了甲醇的含量[18]。
图3 去皮对柿子酒发酵过程中甲醇含量的影响
Fig.3 Effect of peeling on methanol contents in the fermentation process of persimmon wine
2.2.2 蒸煮对柿子酒发酵过程中甲醇的影响
由图4可知，发酵过程中甲醇的含量随发酵的进行而降低，发酵初期蒸煮处理的柿子酒中甲醇含量明显比不蒸煮处理组低，前者为255.56 mg/L，后者为888.22 mg/L，果胶分解是形成甲醇的主要途径之一，蒸煮处理可以使果胶分解，有效减少了果胶的含量，并且蒸煮处理使柿子本身带有的果胶甲酯酶失活[19-20]，抑制了果胶的分解，发酵结束后蒸煮处理柿子酒中甲醇的含量（41.18 mg/L）较不蒸煮处理柿子酒中甲醇含量（59.35 mg/L）低30%。
图4 蒸煮对柿子酒发酵过程中甲醇含量的影响
Fig.4 Effect of cooking on methanol contents in the fermentation process of persimmon wine
2.3 原料预处理对柿子酒发酵过程中高级醇的影响
2.3.1 去皮对柿子酒发酵过程中高级醇的影响
如表1所示，两个处理中的高级醇包括异戊醇、异丁醇和正己醇，含量随发酵时间延长呈现先升高后稳定的趋势，在发酵第2天后达到稳定，其中异戊醇含量相对较高，发酵结束后，原料去皮处理柿子酒中高级醇含量（5.19 g/L）较带皮处理柿子酒中高级醇含量（3.12 g/L）高66%，可能是因为带皮处理中带有的微生物与酿酒微生物形成了竞争关系，减少的微生物的代谢，从而降低高级醇的含量[21]。
表1 去皮对柿子酒发酵过程中高级醇含量的影响
Table 1 Effect of peeling on higher alcohol contents in the fermentation process of persimmon wine
注：“ND”表示未检出。下同。
2.3.2 蒸煮对柿子酒发酵过程中高级醇的影响
蒸煮对柿子酒发酵过程中高级醇的影响如表2所示，原料蒸煮处理可以大大降低高级醇的含量，并且在蒸煮处理的柿子酒中为检测到正己醇，这可能是蒸煮处理抑制了降解代谢途径[22]，发酵结束后蒸煮处理柿子酒中高级醇含量（2.55 g/L）较不蒸煮处理柿子酒中高级醇含量（3.78 g/L）低48%。
表2 蒸煮对柿子酒发酵过程中高级醇含量的影响
Table 2 Effect of cooking on higher alcohol contents in the fermentation process of persimmon wine
3 结论
本实验研究去皮、蒸煮对柿子酒发酵过程中主要理化指标、甲醇和高级醇含量的变化，以筛选出较好的酿造柿子酒的处理方式，对柿子酒工业化生产提供一定的应用价值和指导意义。原料预处理对柿子酒的酒精度没有显著影响；和带皮处理相比，原料去皮处理酿造的柿子酒中还原糖含量高44%，总酸含量低7.9%，甲醇低19%，高级醇高66%；与不蒸煮处理相比，蒸煮处理酿造的柿子酒中还原糖含量高36%，总酸含量低9.5%，甲醇含量低30%，高级醇含量低48%。所以，确定去皮、蒸煮处理为柿子酒较优的原料处理方法。
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