杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我国传统的中药材树种，也是我国特有的“化石级”树种。我国杜仲资源约占世界杜仲资源总量的99%以上[1]。杜仲在河南省分布广泛，涉及102个县（市），东到商丘、郸城；西达灵宝、卢氏；南及泌阳、商城、信阳；北至南乐。河南的西南部是杜仲的主要栽培区之一。其中灵宝市是杜仲雄花茶的主要产区，2014年生产杜仲雄花茶5 t，产值可达7 500万元。杜仲雄花、叶、皮营养价值丰富，其中杜仲雄花黄酮类化合物含量远高于杜仲皮和叶，富含绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平甘酸等活性物质和多种维生素、氨基酸，具有生物抗氧化性，清除自由基、抗衰老等功效[2-3]；也具有降血压、降血脂、防癌、抗癌、抗病毒、增强免疫力等药理活性，且无毒副作用[4]。
国内外专家在医学领域及植物学领域对杜仲进行了大量科学研究。有研究证明，从杜仲中提取多糖组分可以显著促进淋巴细胞增殖，为制备强免疫刺激剂提供思路[5]。杜仲不同部位如杜仲雄花、叶具有与树皮相似的活性成分和药理作用，可以在一定程度上替代树皮，应充分利用独特的资源优势，用于生产保健品[6]。叶文峰等[7]利用杜仲叶为主要原料，研制出风味独特的复合保健饮料，为杜仲开发提供新的思路。杜仲雄花于2014年被国家卫生和计划生育委员会批准为新食品原料，其茶汁富含黄酮类化合物、绿原酸、多酚、桃叶珊瑚苷、京尼平苷等活性物质。严颖等[8]研究发现，杜仲雄花中黄酮苷类成分较杜仲更多，杜仲雄花具有很高的医疗保健价值。发酵的茶饮料则是微生物利用茶汁中的基质进行发酵，在生长代谢和繁殖过程中同时产生多种胞外酶，这些胞外酶和微生物共同作用于茶叶中的活性物质，让这些物质发生氧化、降解、聚合和转化。因此，发酵茶饮料不仅改变了茶叶的品质，且茶汁中的色香味都发生了变化，形成了独特的风味和口感[9-10]。且研究发现植物乳杆菌发酵后的猕猴桃果浆中新生成了2,6-二羟基香豆素、芥子酸和原儿茶酸，提高猕猴桃果浆抗氧化能力[11]。通过发酵手段，提高杜仲雄花茶汁口感及营养成分，为以杜仲雄花为原料的发酵茶相关研究方向提供思路。
因此，本研究以杜仲雄花为原料，采用酿酒酵母（Sac charomycescerevisiae）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）单独和二者复合（1∶1）发酵，测定发酵过程中茶汁的感官指标、理化指标、微生物指标、功效成分指标及抗氧化能力：2,2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）自由基清除率、羟自由基（·OH）清除率、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率以及还原力的变化，以期为开发具有保健功能的杜仲发酵茶饮料产品提供参考，同时也为进一步开拓杜仲茶市场和开发新型杜仲产品提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种和材料
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）GIM1.191和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GIM2.137：广东省微生物菌种保藏中心；杜仲雄花茶（干茶）：中国林科院杜仲研究基地。
1.1.2 化学试剂
无水葡萄糖、水杨酸、过氧化氢（30%）、三氯化铁（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸、硫酸亚铁、亚硝酸钠、硝酸铝、无水碳酸钠、氢氧化钠、苯酚（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；ABTS、DPPH（均为分析纯）：北京中生瑞泰科科技有限公司；铁氰化钾（分析纯）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；绿原酸、芦丁（均为分析纯）：贵州迪大生物科技有限公司；福林酚（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；没食子酸（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：烟台市双双化工有限公司。
1.1.3 培养基
MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基：北京奥博星生物技术责任有限公司。
1.2 仪器与设备
AL204/01型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CT-IBV无菌操作台：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DNP-9272精密恒温培养箱、S20146684低温恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；JY92-2D型超声波仪：宁波新芝生物科技有限公司；HC-3618R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：金坛市华峰仪器有限公司；PAL-1手持糖度计：瑞轩电子科技（上海）有限公司；pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 杜仲雄花茶汁发酵液的制备
杜仲雄花茶与水的料液比1∶50（g∶mL），50 ℃的水浴浸提5 h，浸提完毕，过滤，滤液加入3%的蛋白胨和4%的无水葡萄糖[12-13]，121 ℃灭菌15 min，凉至室温，接种4%植物乳杆菌、4%酿酒酵母及复合菌（2%植物乳杆菌＋2%酿酒酵母），分别于38 ℃、28 ℃和28 ℃条件下进行恒温培养。发酵液每隔24 h取样1次，发酵6 d，重复3次，分别进行品质指标及抗氧化能力测定。
1.3.2 分析检测
（1）感官指标
杜仲雄花茶汁发酵液色泽、香气和滋味通过20人进行感官评价，满分10分。杜仲雄花茶汁发酵液的感官评分标准见表1。
表1 杜仲雄花茶汁发酵液感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of fermentation broth of male Eucommia ulmoides flower tea juice
（2）理化指标
可溶性固形物：用PAL-1手持糖度计测定样品可溶性固形物的含量；透光率：以蒸馏水作为参比，用分光光度法在波长625 nm处测定样品的透光率；pH值采用pH计测定。
（3）功效成分指标
总酚含量测定方法见参考文献[14]。以没食子酸为标准品，绘制标准曲线。以吸光度值（x）为横坐标，没食子酸标准溶液质量浓度（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到回归方程为：y=1.924x+0.042 3（相关系数R2=0.999 6）。按照标准曲线回归方程计算样品中总酚含量。
总黄酮含量测定方法参考白喜婷等[15]的Al（NO3）3-NaNO2比色法。以吸光度值（x）为横坐标，芦丁标准溶液质量浓度（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，得到回归方程为：y=0.111 2x+0.013 2（相关系数R2=0.997 2）。按照标准曲线回归方程计算样品中总黄酮含量。
绿原酸含量测定参照参考文献[16]。以吸光度值（x）为横坐标，绿原酸标准溶液质量浓度（y）为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线，得到回归方程为：y=0.052 4x+0.006 1（相关系数R2=0.999 7）。按照标准曲线回归方程计算样品中绿原酸含量。
多糖含量测定方法参见方崇波等[17]的方法。以吸光度值（x）为横坐标，葡萄糖标准溶液质量浓度（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到回归方程为：y=0.619 7x+0.003 4（相关系数R2=0.991 2）。按照标准曲线回归方程计算样品中多糖含量。
（4）微生物指标
植物乳杆菌检验参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[18]；酿酒酵母检验参考GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》[19]；杜仲雄花茶汁发酵液的大肠杆菌检验参考GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[20]。
（5）抗氧化活性
还原力测定参考李顺峰等[21]的方法。取样品溶液1 mL，加入pH=6.6，0.2 mol/L磷酸缓冲液2.5 mL，1%铁氰化钾2.5mL，50℃保温20 min，急剧冷却加入10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去离子水，再加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，反应30 min，波长700 nm条件下测定其吸光度值。吸光度值越大，则样品的还原力越大，即抗氧化性越强。
OH自由基清除率的测定：参考LI W等[22]的方法。取样品溶液0.5 mL，依次加6 mmol/L的FeSO4和6 mmol/L水杨酸-乙醇各1 mL。混匀后静置10 min，加入8.8 mmol/L H2O2 0.5 mL启动反应，避光静置0.5 h，于波长510 nm条件下测定其吸光度值。OH自由基清除率计算公式如下：
式中：A1为样品的吸光度值；A2为以蒸馏水代替H2O2作样品本底吸光度值；A0为以蒸馏水为对照的吸光度值。
DPPH自由基清除能力的测定：参考SUTTIRAK W等[23]的方法。取2 mL样品，加入2 mL DPPH（2×10-4 mol/L）溶液混合均匀，黑暗处反应30 min，以无水乙醇调零，测定波长517 nm处的吸光度值。DPPH自由基清除率计算公式如下：
式中：A1为样品的吸光度值；A2为以乙醇代替DPPH吸光度值；A3为以乙醇代替样品吸光度值。
ABTS自由基清除能力的测定：参考MILLER N J等[24]的方法。ABTS自由基的制备：固体的ABTS溶解于水中配成7 mmol/L溶液，将7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液混合（1∶0.5），置室温黑暗条件下放置12～16 h后备用。使用前用无水乙醇稀释至吸光度值在7波长34 nm处为0.70±0.02。100 μL样品提取液加到3 mL ABTS自由基溶液中避光反应6 min后，在波长734 nm处测定吸光度值。ABTS自由基清除率计算公式如下：
式中：Ax为加入样品后溶液吸光度值；Ax0为样品溶液本底吸光度值；A0为空白试剂的吸光度值。
1.3.3 数据处理
标准误差（standard error）和作图使用Excel软件（Microsoft2010），Tukey显著性差异计算使用JMP10软件（P＜0.05）。每个评价指标均重复测定3次。
2 结果与分析
2.1 杜仲雄花茶汁发酵前后理化性质、感官评价及总菌数
杜仲雄花茶汁的理化指标及感官评价见表2。
表2 杜仲雄花茶汁的理化性质及感官评价
Table 2 Physical and chemical properties and sensory evaluation of male Eucommia ulmoides flower tea juice
注：同一列不同字母表示有显著差异（P ＜0.05）。
由表2可知，无论是植物乳杆菌、酿酒酵母还是复合菌，发酵后的杜仲雄花茶汁可溶性固形物升高、透光率降低，这与在红茶和乌龙茶乳酸菌发酵的研究结果一致[9]。发酵后的杜仲雄花茶汁可溶性固形物显著上升（P＜0.05），发酵6 d后，植物乳杆菌、酿酒酵母和复合菌发酵的茶汁可溶性固形物分别从0.4%上升至7.6%、5.7%和6.5%，但透光率分别从65.1%下降至45.3%、40.4%和39.9%。这种现象可能是由于发酵过程中物质转化，产生少量沉淀，造成透光率下降。未接菌的杜仲雄花茶汁pH最高，为4.9，发酵6 d后，由植物乳杆菌、酿酒酵母和复合菌发酵的茶汁pH依次为3.1、4.1和3.4。这是由于乳酸菌通常在密封缺氧条件下利用葡萄糖等碳水化合物产生乳酸等有机酸物质，从而引起pH降低；而酵母菌在无氧环境下利用葡萄糖等碳水化合物主要生成CO2与乙醇等，对pH值没有明显影响[25]。由于杜仲雄花本身的颜色较深，所以造成发酵过程中茶汁的色泽变化不明显，一直保持深褐色。香气和滋味方面，酿酒酵母发酵效果最差，而植物乳酸菌发酵效果最好，说明植物乳杆菌可能更适合发酵杜仲雄花茶汁。从理化指标及感官品质来看，杜仲雄花茶汁最佳的发酵菌种依次为植物乳杆菌＞复合菌＞酿酒酵母。
2.2 杜仲雄花茶汁功效成分指标分析
杜仲雄花茶汁发酵后的功效成分变化结果见图1。由图1A可知，未发酵的杜仲雄花茶汁多酚含量为1.91 mg/mL，复合菌发酵1 d时升高最多，增幅为8.3%，与对照有显著差异（P＜0.05）。植物乳杆菌和酿酒酵母单独发酵，杜仲雄花茶汁的多酚含量呈降低趋势，酿酒酵母发酵，茶汁多酚含量在第4天降至最低，降幅为27.7%，与对照差异显著（P＜0.05）；植物乳杆菌发酵，茶汁多酚含量在第1天降至最低，降幅为33.9%。由图1B可知，植物乳杆菌发酵的杜仲雄花茶汁总黄酮含量大幅度增长，且在第5天到达峰值，达6.0 mg/mL，增幅70%。酿酒酵母发酵，茶汁总黄酮含量增幅不大，最大增幅于发酵第2天时，增幅7.5%。复合菌发酵第6天达到峰值，增幅为59.4%。植物乳杆菌和酿酒酵母发酵第4～6天时，总黄酮含量差异不显著；而复合菌发酵的茶汁不同时间的总黄酮含量差异显著（P＜0.05）。由图1C可知，杜仲雄花茶汁经发酵后，绿原酸含量小幅度增加，且三种发酵方式绿原酸含量差别不明显。未发酵茶汁的绿原酸含量为0.46mg/mL。植物乳杆菌和复合菌发酵第1天时达到峰值，增幅依次为29.4%和30.6%；酵母菌发酵第6天才到达峰值，增幅为27.1%。由图1D可知，杜仲雄花茶汁经发酵后，多糖含量整体下降。未发酵茶汁的多糖含量为38.1 mg/mL。植物乳杆菌发酵第3天时，多糖含量最低，降幅为71%；酿酒酵母和复合菌发酵第5天降至最低，降幅依次为42%和66.3%。多酚的少量降低和多糖的含量的大幅度减少，这与代祥青等[26]在发酵型普洱茶中的研究结果一致。发酵过程中植物乳杆菌和酿酒酵母基本上没有消耗多酚，使多酚得到了最大限度地保存。多糖含量的减少则是由于植物乳杆菌和酿酒酵母在发酵的过程中都需要大量糖类物质，糖类被发酵后转化成氨基酸、维生素及部分有机酸，赋予杜仲雄花茶饮料特有的滋味。从功效成分指标来看，杜仲雄花茶汁发酵效果依次为植物乳杆菌＞复合菌＞酿酒酵母。
图1 杜仲雄花茶汁发酵过程中功效成分指标的变化
Fig.1 Changes of functional components indexes of male Eucommia ulmoides flower tea juice during fermentation
A：多酚；B：总黄酮；C：绿原酸；D：多糖。不同字母表示有显著差异（P ＜0.05）。下同。
2.3 杜仲雄花茶汁微生物指标分析
由表2可知，在三种发酵方式接种量相同的情况下，植物乳杆菌单独发酵杜仲雄花茶汁6 d后活菌数最多，可达2.3×107 CFU/mL，是酿酒酵母单独发酵和复合菌发酵的2倍左右（1.1×107 CFU/mL和1.7×107 CFU/mL）。该研究结果与马立娟等[25]在植物乳杆菌和酿酒酵母发酵菠萝汁中的结论一致。产生该现象的原因可能是由于酵母菌生长过程中会代谢产生脂肪酸等一些抑制乳酸菌生长代谢的物质，同时，乳酸菌在生长过程中会产生苯乳酸等一些抑制酵母菌生长代谢的物质，这可能是本研究中植物乳杆菌与酿酒酵母混合发酵总活菌数降低的原因[27]。另外，植物乳杆菌和酿酒酵母单独和复合发酵杜仲雄花茶汁6 d后，经检测大肠菌群＜1 CFU/mL。杜仲雄花茶汁最佳的发酵方式为植物乳杆菌＞复合菌＞酿酒酵母。
2.4 杜仲雄花茶汁抗氧化能力分析[28-29]
图2 杜仲雄花发酵过程中抗氧化能力的变化
Fig.2 Changes of antioxidant capacity of male Eucommia ulmoides flower tea juice during fermentation
A：OH自由基清除率；B：还原力；C：DPPH自由基清除率；D：ABTS自由基清除率。
由图2A可知，杜仲雄花茶汁经过植物乳杆菌发酵后，发酵第2天，茶汁的OH自由基清除能力最高，达到65.7%。1～3 d茶汁的OH自由基清除能力与对照没有显著差异，第4～5天下降明显，茶汁的OH自由基清除率相比对照下降了11.0%和10.7%（P＜0.05）；酿酒酵母发酵后茶汁的OH自由基清除率变化不明显，但第3～4天，茶汁的OH自由基清除率最高，达到68.9%和67.9%（P＜0.05）；复合菌发酵后，第2天茶汁的OH自由基清除率到达68.9%，增幅3.4%。由图2B可知，杜仲雄花茶汁的还原力呈降低趋势，植物乳杆菌发酵第4天，茶汁的还原力最高，达0.478；酿酒酵母发酵第3天降幅最大，相比对照降幅达到26.0%（P＜0.05）；复合菌发酵第1 天时，降幅最大，达22.7%，与对照差异显著（P＜0.05）。由图2C可知，无论是酿酒酵母、植物乳杆菌单独发酵，还是复合菌发酵，与对照相比，茶汁的DPPH自由基清除率基本上没有明显变化，在93%～98%之间。由图2D可知，植物乳杆菌、酿酒酵母和复合菌发酵后，第6天茶汁的ABTS自由基清除率增幅最大，依次达到59.2%，49.3%和61.0%，增幅分别31.5%，67.2%和35.5%，与对照呈显著差异（P＜0.05）。从抗氧化活力来看，杜仲雄花茶汁最佳发酵方式：酿酒酵母＞植物乳杆菌＞复合菌。
3 结论
本研究探讨了植物乳杆菌、酿酒酵母单独和二者复合（1∶1）发酵对杜仲雄花茶汁感官、理化、微生物、功效成分指标及抗氧化能力的影响，综合来看，最佳的发酵方式为植物乳杆菌＞复合菌＞酿酒酵母。植物乳杆菌发酵6 d后，可溶性固形物、透光率、pH依次为7.6%、45.3%和3.1，滋味和香气最佳，活菌数达2.3×107 CFU/mL。绿原酸、总黄酮含量分别在第1、第5天达到峰值，增幅依次为29.4%和70%；多酚、多糖分别在第1、第3天降至最低，降幅依次为33.9%和71%。抗氧化能力方面，植物乳杆菌发酵杜仲雄花茶汁对ABTS、OH、DPPH自由基清除率及还原力最大分别为59.2%、65.7%、97.7%和0.478。研究结果为杜仲雄花产品的开发提供了参考依据。
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