早在两千多年前，高卢地区（Gaul）的人们便用橡木桶储存和运输啤酒，而后罗马帝国士兵发现橡木桶拥有轻便和易运输等优势，便开始使用橡木桶来盛放葡萄酒，随后橡木桶陈酿葡萄酒的好处被人们渐渐发掘出来。许多经过橡木桶陈酿的葡萄酒就好像经过打磨的玉石，纹理层次的细腻感都更上一层楼。
橡木桶用于葡萄酒陈酿，存在于橡木桶中的挥发酚、呋喃醛、萜类、单宁、橡木内酯等由于溶解、浸渍等作用进入到葡萄酒中，增加了酒的风味复杂性；还可以防止因带菌皮而引起酒的过分还原，同时，由于控制氧化的发生而导致红葡萄酒涩味降低，颜色增强、稳定性提高[1]。目前，出于成本的考虑，出现了一些可替代的办法，包括添加橡木片、橡木块和微氧技术，创造一个近似于橡木桶的环境来贮藏葡萄酒，进行葡萄酒的陈酿。国内外有很多关于橡木桶对葡萄酒陈酿过程的研究。刘涛等[2]总结了橡木桶储藏对葡萄酒质量的影响因素，提出了橡木桶贮藏过程中对葡萄酒造成不愉快味道的主要成分是乙烯基苯酚类物质；提出橡木桶和酵母酒泥对葡萄酒香味成分吸附作用及葡萄酒陈酿的系列新技术。张美玲等[3-4]就橡木桶对葡萄酒陈酿中有机酸、花色苷、白藜芦醇等物质的影响也进行了报道。位于法国的欧洲化学和生物研究院的Quidea 及其研究小组称橡木红酒拥有一种可以有效抗肿瘤的多酚物质—acutissimin A。要产生这种物质，需要来自橡木的栎木鞣花素（vescalagin）和来自葡萄中的儿茶酸或表儿茶酸。在研究中发现，acutissimin A比一种临床上用来治疗睾丸癌和肺癌的抗癌药物依托泊苷（4-去甲基表鬼臼毒素-β-D乙叉吡喃葡萄糖苷）的有效率强250倍。其潜在抗癌能力可能来自于它能够抑制DNA逆转录酶II的活性。葡萄酒除去含有酒精和糖分之外，还含有像花青素、白藜芦醇、单宁、氨基酸、维生素以及微量元素等营养成分，红酒中保存了葡萄皮中的多酚类物质，多酚类物质具有很强的抗氧化、抗炎的作用，对人体的心脑血管具有保健作用，减少血液中的低密度脂蛋白，降低血液的凝固性，从而降低心梗、中风发生的风险，还能预防组织器官的老化。日常饮用一点葡萄酒对人的身体大有益处，关于葡萄酒中酚类物质和抗氧化活性的研究也有大量报道[5-6]。
目前，2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazo-line-6-sulfonic acid），ABTS）方法常用来评价一些抗氧化物的抗氧化性，即根据待测化合物清除ABTS自由基引起的吸光度值变化来评价其抗氧化活性，抗氧化性常与待测样品的浓度和反应时间有关，因此，确定恰当的检测反应条件对提高结果准确性意义重大。本实验主要研究了橡木桶陈酿对红葡萄酒抗氧化活性和酚类物质含量的影响，比较ABTS方法测定经橡木桶陈酿和未经橡木桶陈酿的红葡萄酒抗氧化性的反应条件上的差异，并确定最适反应条件，以提高检测效率和准确性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葡萄酒样品分为经橡木桶陈酿和未经陈酿两大类，包括赤霞珠、蛇龙珠、黑比诺、西拉、美乐五个品种，均由张裕公司提供。各供试葡萄酒样品信息见表1。
表1 供试葡萄酒样品信息
Table 1 Information of tested wine samples
续表
ABTS：山东西亚化学股份有限公司；6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）：上海麦克林生化科技有限公司；没食子酸、福林酚和芸香叶苷·三水：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
CP64电子天平：上海庚庚仪器设备有限公司；UV/VIS紫外可见分光光度计：珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司；Multiskan FC型酶标仪：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 总酚、花色苷、黄烷醇含量的测定
总酚含量的测定是参照ODEYEMI S等[7-8]的方法，以没食子酸为标准，采用福林酚法测定；花色苷的测定是参照LUCENA A P S等[9]的pH示差法，总花色苷含量以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计；总黄酮含量的测定是以芦丁为标准的方法进行测定的[10]。所有样品重复三次，最终数据以“平均值±标准误差”来表示。
1.3.2 ABTS法测定红葡萄酒抗氧化活性反应条件的确定
葡萄酒抗氧化性的测定参考李华等[12]的方法。
（1）Trolox标准品的配制：用甲醇配制1 mmol/L的Trolox标准储备液，并将其稀释为0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L、0.8 mmol/L、0.9 mmol/L的不同浓度梯度，使其具有10%～90%的自由基清除能力。
（2）反应液的配制：用pH 4.5醋酸缓冲液分别配制浓度为7 mmol/L ABTS溶液和浓度为2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，并于0～4 ℃避光保存。取等体积的ABTS溶液和过硫酸钾溶液混合为母液，室温避光反应12～16 h备用。量取1.40 mL ABTS母液，用pH 4.5 醋酸缓冲液稀释至32 mL，室温避光放置0.5 h后，于波长734 nm测定其吸光度值为0.74±0.03。
（3）葡萄酒样品的稀释：在经橡木桶陈酿和未经橡木桶陈酿的红葡萄酒样品中，分别选择每个品种的一个葡萄酒样品，将其用蒸馏水稀释成若干浓度，根据预实验结果，未经橡木桶陈酿的红葡萄酒样品的稀释比例（葡萄酒样品体积与稀释后总体积之比）为5∶1 000～6∶100，经橡木桶陈酿的为5∶1 000～4.5∶100。
（4）样品及Trolox的测定方法：参考李媛媛等[11]的方法。待试样品为选取的干红葡萄酒的各个稀释比例的稀释液，反应时间为0～300 min。在96孔板中依次加入200 μL ABTS工作液和10 μL不同浓度的样品溶液和Trolox溶液，摇匀，室温下动态测定波长734 nm处的吸光度值A（n=3）。空白组用pH4.5醋酸缓冲液代替ABTS工作液，对照组用甲醇代替样品溶液。抗氧化活性用Trolox等价抗氧化能力（troloxequivalentantioxidantcapacity，TEAC）值表示，单位为mmol/L。
1.3.3 最佳反应时间和最佳稀释比例的确定
分析反应动力学曲线以确定最佳反应时间范围，在确定好的反应时间下，不同稀释比例的红葡萄酒样品与ABTS工作液反应，若稀释比例在某一区间内与测定的吸光度值或ABTS自由基清除率之间线性相关，此区间的稀释比例即为红葡萄酒的最佳稀释比例范围。
1.3.4 数据处理
采用Excel对数据进行统计、计算和分析。试验数据用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析
2.1 最佳反应时间的确定
未经陈酿和经陈酿的红酒对ABTS自由基清除活性的影响见图1和图2。在反应初期20 min时，样品的自由基清除能力有一个快速的提升，这说明，在反应刚开始时，由于物质浓度较大，化学反应速率较快；在反应后期，自由基清除率减幅逐渐变小，反应速率逐渐降低后趋于平稳。另外，对于抗氧化性相对较高的葡萄品种来说，高浓度的样品与ABTS自由基反应迅速，短时间内就已经反应完全。
图1 未经陈酿的红酒对ABTS自由基清除活性随时间的变化
Fig.1 Changes of ABTS free radical scavenging activities of unaged red wines with time
由图1可知，对于未经陈酿的红酒来说，不同稀释比例的红葡萄酒样品反应220～260 min时，其ABTS自由基清除率的线性趋势均很明显，如红葡萄酒的稀释比例为3∶100时，蛇龙珠、赤霞珠、美乐和黑比诺ABTS自由基清除率的线性R2分别为0.994 3，0.993 7，0.996 5和0.995 1，即红葡萄酒中的抗氧化物质清除ABTS+的速率在220～260 min时基本趋于稳定，这一时间段的测定值可以反应红葡萄酒酒样的本征抗氧化性。同时，由图1分析得到，反应220 min、240 min和260 min时的TEAC值差异不大。因此，将220～260 min视为酶标仪-ABTS方法测定未经橡木桶陈酿红葡萄酒抗氧化活性的最佳反应时间范围，具体的反应时间可根据待测样品的数量酌情选择。
图2 经陈酿的红酒对ABTS自由基清除活性随时间的变化
Fig.2 Changes of ABTS free radical scavenging activities of aged red wines with time
由图2可知，对于经过陈酿的红葡萄酒来说，不同稀释比例的红葡萄酒在反应进行到240～280 min时，ABTS自由基清除率的线性趋势明显，如红葡萄酒的稀释比例为2.5∶100时，蛇龙珠、赤霞珠、美乐和西拉四种红葡萄酒的自由基清除率的线性相关系数R2分别为0.994 8，0.994 1，0.997 2，0.996 1，表示红葡萄酒的自由基清除率在240～280 min时基本趋于稳定，且240 min、260 min和280 min时TEAC值差异不大，因此，经橡木桶陈酿的红葡萄酒的抗氧化活性测定时间范围为240～280 min。通过比较未经橡木桶陈酿和经橡木桶陈酿的红酒的最佳反应时间范围发现，二者在最佳反应时间上差别不大。
2.2 最佳稀释比例的确定
以不同稀释比例的葡萄酒反应240 min为例，葡萄酒样品的不同稀释比例对ABTS自由基清除率的影响见图3。
图3 不同稀释比例葡萄酒样品对ABTS自由基清除活性的影响
Fig.3 Effect of wine samples dilution ratio on ABTS free radical scavenging activities
A为未经橡木桶陈酿的红葡萄酒；B为经橡木桶陈酿的红葡萄酒。1～7分别代表稀释比例为1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100。
由图3A可知，对于未经橡木桶陈酿的红葡萄酒来说，蛇龙珠、赤霞珠、美乐、黑比诺红葡萄酒的稀释比例分别为3∶100～5∶100（图A中为3～5）、2.5∶100～4.5∶100、3∶100～4∶100和2.5∶100～4∶100时，线性相关系数R2分别为0.999 8、0.997 6、0.999 4、0.995 0，说明不同品种葡萄酒样品在一定的稀释比例范围内与自由基清除率有明显的线性趋势。因此，为了满足所有品种红葡萄酒的测试要求，选择3∶100～4∶100为酶标仪-ABTS方法测定未经橡木桶陈酿的红葡萄酒的抗氧化活性的最佳稀释比例范围。
由图3B可知，蛇龙珠、赤霞珠两种红葡萄酒的稀释比例为1∶100～2∶100（图B中为1～2）时，美乐和西拉的稀释比例分别为0.5∶100～2∶100和0.5∶100～2.5∶100时，稀释比例与自由基清除率的线性关系较好，相关系数R2分别为0.999 0和0.998 3，0.997 6和0.997 0。为满足不同品种红葡萄酒的测试要求，选择1∶100～2∶100为酶标仪-ABTS方法测定经橡木桶陈酿的红葡萄酒抗氧化性的最佳稀释比例范围。
通过比较未经橡木桶陈酿的红葡萄酒和经陈酿的红葡萄酒的测定结果，发现二者在测定的最佳稀释比例上存在差异，未经橡木桶处理的红酒的最佳稀释比例范围为3∶100～4∶100，而经橡木桶陈酿的红酒的稀释比例在1∶100～2∶100范围内，与ABTS自由基清除率的线性关系更好。
2.3 酚类物质含量与抗氧化活性大小比较与分析
实验所得Trolox对ABTS自由基清除率的标准曲线回归方程为y=91.422x+3.744，相关系数R2=0.999 4。表示在0.1～0.9 mmol/L范围内，Trolox的浓度与自由基清除率线性关系良好。
根据2.1和2.2确定的反应条件，测定所有红葡萄酒样品的抗氧化性，结果用TEAC值表示，实验反应条件为：未经橡木桶陈酿的红葡萄酒样的稀释比例选择3.5∶100，反应时间为260 min；经橡木桶陈酿的红葡萄酒样的稀释比例为2∶100，反应时间为260 min。红葡萄酒样品的酚类物质含量和抗氧化活性结果见表2。
表2 供试葡萄酒样品的酚类物质含量和抗氧化能力
Table 2 Phenolic substances contents and antioxidant capacity of tested wine samples
图4 供试葡萄酒样品的酚类物质含量和抗氧化性
Fig.4 Phenolic substances contents and antioxidant capacity of tested wine samples
图B中花色苷和总黄酮含量的单位为mg/L；TEAC单位为mmol/L。
葡萄酒的酚类成分取决于葡萄品种、葡萄园环境因素、葡萄酒的加工工艺、成熟过程中的土壤和大气条件以及陈化过程等[13]。由表2可知，未经橡木桶陈酿的红葡萄酒样品中，不同品种红葡萄酒的总酚、花色苷、总黄酮含量和抗氧化活性大小按照赤霞珠＞美乐＞蛇龙珠＞黑比诺的顺序依次递减。陕西的美乐葡萄酒具有最高的总酚含量，2 533.42 mg/L，和抗氧化活性，TEAC值高达27.82 mmol/L。来自宁夏银川的黑比诺R1和烟台的蛇龙珠葡萄酒R3在酚类物质含量和抗氧化活性上都表现较低水平。
经橡木桶陈酿的红葡萄酒中，陕西的样品R13具有最高的总酚（3214.86 mg/L）、花色苷（27.22 mg/L）、总黄酮（96.95 mg/L）含量和TEAC值（42.41 mmol/L），其总酚含量和TEAC值是新疆西拉葡萄酒的2倍。其次是北京的两个赤霞珠红葡萄酒（R14和R15）和烟台的蛇龙珠葡萄酒。通过比较烟台R7和陕西R8两个地区的美乐葡萄酒发现，样品R8在酚类物质含量和抗氧化活性上都要高于样品R7，这与地区特殊的地理位置和气候条件有关[14]。
由表2和图4可知，橡木桶陈酿对红葡萄酒酚类物质含量和抗氧化活性有影响。未经橡木桶陈酿的红葡萄酒样品无论是酚类物质含量，还是能表示抗氧化能力的TEAC值都要低于经过橡木桶陈酿的红葡萄酒，经橡木桶陈酿过的红葡萄酒的酚类物质含量比未经橡木桶处理的红葡萄酒高12%，经橡木桶陈酿的红葡萄酒的花色苷含量均值达17.75 mg/L，是未经橡木桶陈酿的红葡萄酒的2倍，总黄酮含量高16%，TEAC值高28%，但是经橡木桶陈酿的红葡萄酒样品的总酚含量相较于未经橡木桶陈酿的红葡萄酒样品分布更加分散。同为烟台产区的蛇龙珠，经橡木桶陈酿的红葡萄酒R9-R12在总酚、花色苷、黄酮含量和TEAC值都要高于未经橡木桶陈酿的样品R2和R3。
更多的，由表2分析可以看出，酚类物质含量与抗氧化活性TEAC值之间存在着正相关的关系，这说明，酚类物质的积累使得红葡萄酒具有更高的抗氧化能力，这与大量文献中报道的结果一致[15-18]。然而，也并不排除不同种类的酚类物质之间的协同作用的可能性，通过比较样品R9、R14、R15、R16、R17发现，花色苷含量的降低，抗氧化活性并没有随之降低，相似的实验结果在ZAFRILLA P等[19]的报道中也曾提及。红葡萄酒中还存在着维生素和矿物质等许多其他生物活性化合物，他们的协同作用也可能与红葡萄酒的自由基清除能力有关。高品质的红葡萄酒一般需要一段时间的陈酿，在此期间，天然葡萄酚类中发生氧化、水解和其他转化作用。橡木桶中红酒的老化是一种昂贵的做法，因此，它也暗示了巨大的成本[20]，因此添加橡木片也成为葡萄酒陈化的一种方式。相关研究报道，随着陈化时间的延长，酚酸和儿茶素含量降低，而黄酮、花青素和高分子量原花青素含量增加，抗氧化活性与橡木片切片用量和陈化时间有关[21]。
3 结论
应用酶标仪，采用ABTS方法动态监测未经橡木桶陈酿和经橡木桶陈酿的两类红葡萄酒的反应过程，以确定适合检测的最佳反应条件。试验所得适合未经橡木桶陈酿的葡萄酒的最佳反应时间范围为220～260 min，最佳样品稀释比例范围为3∶100～4∶100，经橡木桶陈酿的红葡萄酒抗氧化活性的最佳反应时间范围是240～280 min，最佳稀释比例范围为1∶100～2∶100。此外，结果还表明经橡木桶陈酿过的红酒具有更高的酚类物质含量和抗氧化活性，因此橡木桶陈酿对红葡萄酒品质的提高具有积极作用。本试验建立的酶标仪微型ABTS方法测定红酒抗氧化活性的方法，操作简单，样品消耗量少，效率高，可同时测定多个样品。葡萄酒在橡木桶中的陈酿是一个复杂的过程，其变化依赖于诸多因素，因此，许多方面还需要更进一步的研究。
[1]李记明，李华.橡木桶与葡萄酒陈酿[J].食品与发酵工业，1998，24（6）：57-59.
[2]刘涛，吕文，闫军，等.橡木桶陈酿对红葡萄酒的作用与影响的研究[J].酿酒，2008（6）：81-83.
[3]张美玲，高年发，王树生，等.橡木桶陈酿对红葡萄酒中白藜芦醇含量的影响[J].中国酿造，2008，27（3）：20-22.
[4]张会宁，刘延琳，胡立志.橡木桶陈酿过程中葡萄酒有机酸的变化[J].中国酿造，2014，33（1）：60-63.
[5]SERUGA M,NOVAK I,JAKOBEK L.Determination of polyphenols content and antioxidant activity of some red wines by differential pulse voltammetry,HPLC and spectrophotometric methods[J].Food Chem,2011,124(3):1208-1216.
[6]CHENG G,FA J Q,XI Z M,et al.Research on the quality of the wine grapes in corridor area of China[J].Food Sci Technol,2015,35(1):38-44.
[7]ODEYEMI S,AFOLAYAN A,BRADLEY G.Phytochemical analysis and anti-oxidant activities of Albuca bracteata Jacq.and Albuca setosa Jacq bulb extracts used for the management of diabetes in the Eastern Cape,South Africa[J].Asian Pac J Trop Biomed,2017,7(6):577-584.
[8]RAPISARDA P,TOMAINO A,LO CASCIO R,et al.Antioxidant effectiveness as influenced by phenolic content of fresh orange juices[J].J Agr Food Chem,1999,47(11):4718-4723.
[9]LUCENA A P S,NASCIMENTO R J B,MACIEL J A C,et al.Antioxidant activity and phenolics content of selected Brazilian wines[J].J Food Compos Anal,2010,23(1):30-36.
[10]GUO C,FA J Q,XI Z M,et al.Research on the quality of the wine grapes in corridor area of China[J].J Nucl Sci Technol,2015,35(1):38-44.
[11]李媛媛，李灵犀，崔艳，等.微型DPPH、ABTS 和FRAP 法动态监测从红酒中分离得到的不同种类多酚化合物的抗氧化活性[J].现代食品科技，2017，33（8）：130-140.
[12]李华，李勇，吴莹，等.ABTS·+法测定葡萄酒抗氧化活性的研究[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2009，37（11）：90-96.
[13]GRANATO D,KATAYAMA F C U,CASTRO I A.Assessing the association between phenolic compounds and the antioxidant activity of Brazilian red wines using chemometrics[J].LWT-Food Sci Technol,2010,43(10):1542-1549.
[14]CHANG T T,LI J M,LI C,et al.Analysis of phenolic compounds and antioxidant properties of wines from three wine grape-growing regions in China[J].Int J Food Eng,2019,5(4):282-292.
[15]ROMERO-DIEZ R,RODREGUEZ-ROJO S,COCERO M J,et al.Phenolic characterization of aging wine lees:Correlation with antioxidant activities[J].Food Chem,2018,259:188-195.
[16]VAN L R,KEVERS C,PINCEMAIL J,et al.Antioxidant capacity and phenolic composition of red wines from various grape varieties:Specificity of Pinot Noir[J].J Food Compos Anal,2014,36(1-2):40-50.
[17]FERNANDEZ-PACHON M S,VILLANO D,TRONCOSO A M,et al.Determination of the phenolic composition of sherry and table white wines by liquid chromatography and their relation with antioxidant activity[J].Anal Chim Acta,2006,563(1-2):101-108.
[18]JIANG B,ZHANG Z.Comparison on phenolic compounds and antioxidant properties of Cabernet Sauvignon and merlot wines from four wine grape-growing regions in China[J].Molecules,2012,17(8):8804-8821.
[19]ZAFRILLA P,MORILLAS J,MULERO J,et al.Changes during storage in conventional and ecological wine:phenolic content and antioxidant activity[J].J Agr Food Chem,2003,51(16):4694-4700.
[20]PERI P,KAMILOGLU S,CAPANOGLU E,et al.Investigating the effect of aging on the phenolic content,antioxidant activity and anthocyanins in Turkish wines[J].J Food Process Preservat,2015,6(39):1845-1853.
[21]DUMITRIU G,LERMA N L,COTEA V V,et al.Effect of aging time,dosage and toasting level of oak chips on the color parameters,phenolic compounds and antioxidant activity of red wines(var.Feteascǎ neagrǎ)[J].Eur Food Res Technol,2016,242(12):2171-2180.