果醋以水果或果汁为原料酿制而成，兼具水果和醋的营养与功能特性[1-2]，因此深受消费者青睐，成为功能性果蔬饮料和果品深加工的研究热点。多种常见的水果，如苹果、梨、桃、葡萄、柿、石榴、草莓、橙、柠檬等[3-7]都被开发成果醋或果醋饮料，赋予其独特的营养价值和保健功能[8]。
红枣是我国传统的养生佳品，富含糖、有机酸、维生素、氨基酸、矿质元素[9-10]以及多酚、多糖、环核苷酸、三萜类化合物等营养物质和功能性成分[11]，具有补气补血、防癌抗癌、保肝护肝、调节免疫等多种生理功效[12]，是人类健康饮食和研制开发功能性食品的重要原料。近年来随着红枣产量的快速提高和果醋饮料的兴起，利用不同品种的鲜枣或残次红枣酿制枣醋成为研究的热点，枣醋的酿造工艺得到了较多研究。杨小波等[13]采用沪酿1.01醋酸菌，通过正交试验确定灵武长枣醋醋酸发酵的最佳工艺参数；王世忠等[14]采用木醋杆菌发酵冬枣酒，得到酸度为5.2 g/100 mL、枣香浓厚的冬枣醋；谌井冈[15]采用液态表面静态发酵法生产红枣醋，发酵时间较固态发酵大为缩短，而风味物质含量较液态深层发酵增加。但这些研究多集中于间歇式发酵方式，周期较长。半连续液态深层发酵是在发酵后期通过周期性的排放发酵液同时补入新鲜料液的发酵方式，有利于维持醋酸菌的发酵能力，避免菌种老化，减少代谢阻遏，也不需要严格的无菌条件，因此在生产食醋或果醋方面得到广泛应用[16]。向进乐等[17]以残次鲜枣为原料，采用半自动连续醋酸发酵法酿制枣醋，证实该方法可用于快速酿造红枣醋，但未对不同工艺条件的影响进行进一步研究。已有研究表明，果醋发酵受原料、菌种、溶氧量以及发酵方式等的影响，尤其是溶氧量，对于醋酸菌的生长和醋酸发酵具有决定性作用[18]。
本研究以新疆灰枣酿制的红枣酒为原料，采用半连续液态深层发酵，探讨不同接种量和溶氧条件对红枣酒醋酸发酵的影响，并对不同发酵批次红枣醋的多酚含量和抗氧化活性进行比较分析，以期为红枣醋的连续快速发酵提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红枣酒：以新疆灰枣为原料，加3倍水煮制、打浆，接入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）发酵后经过滤、澄清得到，酒精度为14%vol，总糖含量2.93 g/100 mL，pH为3.74。
醋酸菌菌种：巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）沪酿1.01，上海佳民酿造食品有限公司。
醋酸菌培养基：葡萄糖1.00 g，酵母膏1.00 g，无水乙醇3.5 mL，碳酸钙2.00 g，琼脂1.5 g，蒸馏水100 mL，调pH值至6.8。
醋酸菌活化培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，调pH值至4.5，121 ℃灭菌20 min，使用前添加3%乙醇。
2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、Folin-酚试剂、2,2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2,2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid）diammonium salt，ABTS]、没食子酸、芦丁、乙酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸（均为分析纯）：美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Biotech-10BG发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司；ZHWY-2112B恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；1525高效液相色谱（high performance liquid chro matography，HPLC）仪：美国Waters公司；SPECORD 50型紫外/可见分光光度计：德国耶拿分析仪器股份公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化与种子液培养
醋酸菌斜面保藏菌种经转接活化后接入液体活化培养基，在30 ℃条件下振荡培养48 h，然后以10%的接种量接入4%vol枣酒，驯化培养48 h，至产酸量为（1.3～1.5）g/100 mL，作为种子液。
1.3.2 单批次发酵试验
（1）接种量对红枣酒醋酸发酵的影响
10 L发酵罐中装入4 L枣酒（加入蒸馏水调整酒精度为6%vol），分别按照10%、20%接种量接入培养好的醋酸菌种子液，控制通气量保持溶氧10%，搅拌转速500 r/min，在28 ℃条件下发酵，每间隔一定时间取样测定总酸含量，考察不同接种量对红枣酒醋酸发酵的影响。
（2）溶氧量对红枣酒醋酸发酵的影响
10 L发酵罐中装入4 L枣酒（加入蒸馏水调整酒精度为6%vol），按照20%接种量接入培养好的醋酸菌种子液，控制通气量保持溶氧量分别为5%、10%和15%，搅拌转速500 r/min，在28 ℃条件下发酵，每间隔一定时间取样测定总酸含量，考察不同溶氧量对红枣酒醋酸发酵的影响。
1.3.3 枣醋发酵过程中有机酸组成变化
10 L发酵罐中装入4 L枣酒（加入蒸馏水调整酒精度为6%vol），按照20%接种量接入培养好的醋酸菌种子液，控制通气量保持溶氧10%，搅拌转速500 r/min，在28 ℃条件下发酵，发酵17 h后每间隔2 h取样分析有机酸组成，考察红枣酒醋酸发酵过程中有机酸的变化。
1.3.4 分割留种半连续发酵试验
使用10 L发酵罐，初始枣酒酒度4%vol，装液系数60%，搅拌转速500 r/min，控制通气量保持溶氧10%，温度28 ℃条件下发酵。当通气量不变条件下溶氧开始上升时出醋，并补充枣酒进行下一批次发酵。发酵过程中每间隔一定时间取样测定总酸含量，分别考察40%和50%留种量对发酵进程的影响以及醋酸发酵的稳定性。
1.3.5 分析方法
总酸含量测定参照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》，以乙酸计。总酚采用Folin-酚法[19]测定，以没食子酸为标准品制作标准曲线计算含量。总黄酮采用硝酸铝比色法[20]测定，以芦丁为标准品制作标准曲线计算含量。
有机酸组成分析采用高效液相色谱法[21]，以乙酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、柠檬酸、富马酸为标准品采用外标法测定发酵液中有机酸的组成与含量。
1.3.6 抗氧化活性测定
分别采用DPPH自由基清除法[22]、铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）法[23]和ABTS自由基清除法[24]进行抗氧化活性测定，以抗坏血酸（vitamin C，VC）为标准品制作标准曲线计算抗氧化活性，结果以VC当量表示。
1.3.7 数据处理
采用Excel和SPSS22.0软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 单批次发酵试验
2.1.1 接种量对红枣酒醋酸发酵的影响
接种量为10%和20%时的醋酸发酵曲线见图1。前20 h以内发酵缓慢，21 h之后产酸量及产酸速率均快速增加，至27～31 h时产酸速率达到高峰，其后急剧下降，从而导致总酸含量在33～35 h时基本趋于稳定。当接种量为20%时，发酵迟滞期明显缩短，15 h之后就开始快速产酸，27 h后产酸速率大幅下降，总酸含量基本趋于稳定，说明已接近发酵终点。但从最终产酸量来看，二者之间无显著差异。
图1 接种量对红枣酒醋酸发酵的影响
Fig.1 Effect of inoculum on acetic acid fermentation of jujube wine
2.1.2 溶氧对红枣酒醋酸发酵的影响
醋酸发酵是一个需氧过程，溶氧条件对醋酸菌生长和酒精醋化都具有重要影响[23]。不同溶氧条件下的醋酸发酵曲线见图2。
图2 不同溶氧条件下的醋酸发酵曲线
Fig.2 Curves of acetic acid fermentation under different oxygen dissolution conditions
由图2可知，随着溶氧量的增加，发酵进程加快，15%溶氧量最早到达发酵终点，但由于通气量加大造成乙醇和乙酸损失，导致最终产酸量较低。5%溶氧量与10%溶氧量到达发酵终点的时间相近，但最终产酸量略低于10%溶氧量。这可能是因为供氧量过低限制了醋酸菌的生长和发酵。
不同溶氧条件对产酸速率的影响见图3。由图3可知，从产酸速率来看，19h以前不同溶氧量之间差异显著（P＜0.05），溶氧量越高，产酸速率越大。但15%溶氧量在19 h之后即进入稳定产酸期，一直到25 h后产酸速率大幅降低，接近发酵终点。而5%和10%溶氧量在21 h之后产酸速率变化趋于一致，23 h之后进入稳定产酸期，27 h后产酸速率大幅下降，接近发酵终点。由于前期5%溶氧量产酸速率较低，因此整个发酵过程其平均产酸速率也低于10%溶氧量。综合考虑产酸量和产酸速率，溶氧量以10%为宜。
图3 不同溶氧量对产酸速率的影响
Fig.3 Effect of dissolved oxygen amount on acid production rate
2.2 枣醋发酵过程中有机酸组成变化
有机酸是果醋中最重要的风味成分和营养物质，其中醋酸是发酵过程中生成的最主要的有机酸，也是果醋的特征性成分。为了解红枣醋发酵过程中醋酸的形成规律以及其他有机酸的代谢情况，对枣醋发酵过程中有机酸的组成进行了分析，结果见表1。
表1 红枣酒醋酸发酵过程中有机酸组成的变化
Table 1 Changes of organic acid profile during acetic acid fermentation of jujube wine mg/100 mL
注：同一行数字之后字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
由表1可知，枣醋发酵液中主要含有乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、奎宁酸、酒石酸和少量莽草酸、富马酸。乙酸是枣醋及其发酵液中最主要的有机酸，而且在发酵过程中一直呈快速增加趋势，发酵结束时乙酸含量达到4 812.35 mg/100 mL，是初始发酵时的23.97倍，占总有机酸的比例也从38.21%提高至94.58%，说明乙酸是发酵过程中的主要产物。除乙酸外，奎宁酸含量在快速产酸初期也增加一倍以上，但随后又逐渐降低，至发酵末期又恢复到醋酸发酵前的水平。而苹果酸含量则是在发酵前期大幅提升，进入快速产酸期后又快速降低到醋酸发酵前的水平。乳酸含量在醋酸发酵初期显著下降（P＜0.05），其后基本维持稳定，发酵结束时降低至43.55 mg/100 mL。酒石酸、柠檬酸、莽草酸、富马酸含量在发酵过程中变化很小。向进乐等[25]在桃醋液态发酵的研究中也发现，苹果酸含量在醋酸发酵前期大幅升高，其后又逐渐降低，而乳酸含量则在整个醋酸发酵阶段一直呈降低趋势。这可能是因为在醋酸菌快速生长与发酵过程中需要大量的能量，苹果酸、乳酸和奎宁酸作为营养物质被代谢或转化[26]。
图4 红枣醋半连续液态深层发酵曲线
Fig.4 Curves of semi-continuous submerged fermentation of jujube vinegar
A：留种50%；B：留种40%。
2.3 分割留种半连续发酵
考虑到醋酸菌在连续发酵过程中一直处于高酸环境中对醋酸菌生长不利，因此采用4%vol枣酒进行分割留种半连续发酵试验，既能达到总酸含量≥3.5%的要求，又可保持醋酸菌的旺盛生长和发酵能力。留种50%和40%条件下的半连续发酵曲线见图4。
由图4A可知，在连续4个批次的发酵中，产酸规律基本一致，发酵周期在14.5～15.5 h，总酸含量在3.77～3.95 g/100 mL。说明分割留种可以实现稳定连续快速发酵。降低留种量会导致发酵周期的延长。由图4B可知，40%留种量条件下迟滞期大幅延长，从而导致发酵周期较50%留种量延长一倍左右，但对产酸水平影响不大，发酵枣醋总酸含量可达3.78～3.92 g/100 mL。因此，在分割留种半连续发酵生产中，必须综合考虑生产效率，兼顾发酵周期和出醋量，以确定适宜的留种量。
2.4 红枣醋的酚类物质含量和抗氧化活性
为考察半连续发酵对红枣醋中酚类物质含量及抗氧化活性的影响，对留种50%连续发酵的4个批次的醋的总酚、总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力、Fe3+还原能力、ABTS自由基清除能力进行测定，结果见表2。
表2 红枣酒和不同批次红枣醋的酚类物质含量和抗氧化活性
Table 2 Total phenolics,flavonoids contents and antioxidant activity of jujube liquor and different batches of jujube vinegar
注：同一列数字之后字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。
由表2可知，红枣酒经过醋酸菌发酵后，红枣醋中的总酚和总黄酮含量均有不同程度的提高，尤其是总黄酮含量，4个发酵批次红枣醋较红枣酒平均提高了42.98%，而且各批次红枣醋与红枣酒之间均有显著差异（P＜0.05）；总酚含量较红枣酒平均提高16.59%，除第1批次外，其他各批次红枣醋与红枣酒之间均有显著差异（P＜0.05）。用DPPH法、FRAP法和ABTS法测定的红枣醋的抗氧化活性和原来的红枣酒相比也分别增加了24.66%、27.87%和38.07%。这说明红枣酒经醋酸菌发酵可提高其酚类物质含量和抗氧化活性。其原因可能是发酵过程中微生物的作用促进了酚类物质的溶出或者生物转化导致一些酚类物质或抗氧化成分的生成。ZOU B等[27]在对柿醋发酵过程的研究中也发现，醋酸发酵可显著提高其ABTS自由基清除能力（P＜0.05），但总酚含量没有显著差别。枳椇酒经醋酸发酵后，总酚、总黄酮含量以及DPPH自由基清除能力均得到明显提高[28]。这都与本研究结果相似，也说明醋酸菌发酵可作为提升果蔬加工产品功能特性的一个重要手段。
3 结论
采用半连续液态深层发酵法可快速酿制红枣醋，溶氧量以控制在10%左右为宜，分割留种量50%时发酵周期为14.5～15.5 h，较分割留种量40%时缩短一半左右。红枣酒醋酸发酵初期伴随奎宁酸和苹果酸含量的大幅增加，但在后续的快速产酸阶段又逐渐降低至发酵前的水平，而乳酸含量在醋酸发酵初期即快速降低，而后保持平稳。枣酒经过醋酸菌发酵后，其中的总酚和总黄酮含量以及抗氧化活性均得到不同程度的提高，因此可以作为增强红枣产品功能特性的加工手段。
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