山茱萸（Cornus officinalis Sieb.Et Zucc.）为山茱萸科植物的干燥成熟果肉，别名枣皮、山芋肉。主产于陕西、山西、河南等省，是我国传统的滋补中药材，具有补益肝肾、收涩固脱的功效[1]，用于治疗眩晕耳鸣、腰酸遗精、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴等病症[2]。山茱萸果肉中含有环烯醚萜苷类、有机酸、鞣质、多糖、酯类等多种化学成分[3-6]，具有代表性的功能活性成分为莫诺苷、马钱苷、齐墩果酸和熊果酸等[7-8]。山茱萸果肉中还含有丰富的矿物质元素、维生素A（vitamin A，VA）、维生素C（vitamin C，VC）及多种氨基酸成分[9-10]。现代药理研究表明，山茱萸具有抗氧化、抗炎、降血糖、保护神经及改善记忆等作用[11-12]。报道显示，山茱萸多糖可改善大鼠的记忆、延缓衰老，扶植肠道的正常菌群的生长，促进肠道双歧杆菌和乳杆菌的增殖，调节肠道菌群失调[13]。山茱萸多糖及山茱萸中的有机酸和酯类有很好的抗氧化作用。山茱萸的活性成分莫诺苷在抗氧化应激损伤、抑制Ca2+失衡和细胞凋亡方面具有重要的调节作用，这些作用与其降低胞内乳酸脱氢酶的释放，抑制细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的蓄积，抑制细胞内游离Ca2+浓度增加及细胞内凋亡蛋白“Caspase-3”的表达有关[14]。以上研究成果提示，山茱萸在保健品和药品领域的开发和应用具有广阔的前景。
山茱萸在我国被列入药食同源目录，故其是保健食品的重要原料来源。利用山茱萸果肉加工酿制而成的果酒，具有酒度低、风味独特、营养价值高等优点[10]。然而，由于生产原料本身及生产工艺等因素的影响，山茱萸果酒在贮藏过程中，易产生浑浊和沉淀，影响果酒的品质。果酒的稳定性较差，易出现浑浊沉淀。果酒沉淀的形成与酒中的微生物、大分子物质和金属离子有关[15]。果酒沉淀形成的机制较为复杂，根据酒体的特性选择合适的澄清方式，是当前消除沉淀的一种思路。果酒的澄清方法包括物理澄清法、化学澄清法及生物澄清法。物理澄清法有冷冻法和吸附法。化学沉淀法是利用澄清剂来达到澄清目的的一种方法，所选用的澄清剂有明胶、膨润土、壳聚糖和植物型澄清剂等。有研究者尝试将不同澄清剂配合使用，达到了更好的澄清效果[16]。生物澄清法是利用酶制剂对果胶等物质水解而使果酒澄清的一种方法。研究表明[17-18]，采用果胶酶澄清工艺对果汁能够达到较好的澄清效果。本研究采用果胶酶对山茱萸果酒进行澄清处理，在单因素试验基础上，通过正交试验优化澄清工艺，并以1,1-二苯基硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（DPPH·）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基（ABTS+·）、羟基自由基（·OH）清除率分析其抗氧化活性，以期为山茱萸深加工利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 原料与试剂
山茱萸果酒：本实验室自酿；果胶酶（酶活2万U/g）：上海蓝季生物有限公司；DPPH、ABTS：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SKG A9打浆机：广东艾诗凯奇智能科技有限公司；LAL2T型折光仪：广州市速为电子科技有限公司；722分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；PHS-2F pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；JA5003N电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；SPL-250恒温培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 山茱萸果酒的澄清
在山茱萸果酒中加入不同添加量的果胶酶，在不同的酶解温度和时间条件下进行果酒的澄清，取澄清液进行澄清度检测，以考察各因素对澄清效果的影响。
1.3.2 澄清度的检测
采用分光光度法，以蒸馏水作为空白，在波长550 nm处用1 cm比色杯测其透光率（%），用透光率表示果酒的澄清度。测定前，将处理后的果酒在3 500 r/min条件下离心10 min，取上层澄清液测其透光率。
1.3.3 澄清工艺优化单因素试验
果胶酶用量：取5份10 mL的山茱萸果酒置于试管中，分别按0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的添加量将果胶酶添加于盛有果酒的试管中，充分混匀后，在40 ℃的恒温水浴锅中酶解120 min，然后测其透光率，分析果胶酶用量对山茱萸果酒澄清度的影响。
酶解温度：取5份10 mL的山茱萸果酒置于试管中，加入0.04%的果胶酶，酶解时间120 min，分别在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃的温度条件下，进行澄清试验，分析酶解温度对山茱萸果酒澄清度的影响。
酶解时间：取5份10 mL的山茱萸果酒置于试管中，加入0.04%的果胶酶，分别固定酶解时间为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，分析酶解时间对山茱萸果酒澄清度的影响。
1.3.4 澄清工艺优化正交试验
根据单因素试验结果，进一步优化山茱萸果酒酶解澄清工艺条件。选择变量因素果胶酶添加量（A）、酶解温度（B）、酶解时间（C）作为变量因子，设计3因素3水平正交试验。正交试验因素编码和水平见表1。
表1 澄清工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for clarification process optimization
1.3.5 山茱萸果酒感官指标、理化指标和微生物指标检测
感官指标：山茱萸果酒的感官评分标准见表2。参考相关报道方法[19]，从色泽、香气、风味和口感对山茱萸果酒进行打分，取10位专家评分的平均值为最终分值，满分100分。
表2 山茱萸果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of dogwood fruitwine
理化指标：山茱萸果酒的酒精度含量按照GB5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测度》中方法测定；基本指标按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》规定的方法测定。
微生物指标：菌落总数按照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》规定方法进行测定；大肠菌群按照GB 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》规定方法进行测定。
1.3.6 山茱萸果酒的抗氧化能力检测
参照贺江等[20]报道的方法，检测山茱萸果酒对DPPH·、ABTS+·及OH·的清除能力。
将DPPH配制成100 μmol/L的DPPH-乙醇工作液，现配现用。取100 μL的果酒样加入离心管中，之后加500 μL DPPH-乙醇工作液，以蒸馏水代替酒样设空白组，无水乙醇代替DPPH-乙醇工作液设对照组，以VC溶液为阳性对照组，加DPPH-乙醇工作液后，充分混匀，避光静置30 min。测定517 nm波长条件下的吸光度值。每个样品重复3次样品DPPH·的清除率计算公式如下：
式中：A1为果酒样组或VC组的吸光度值；A2为对照组吸光度值；A0为空白组吸光度值。
将5 mL ABTS（7 mmol/L）溶液与2.5 mL K2S2O8（7.35 mmol/L）混合后避光反应12 h，取1 mL反应液用0.2 mol/L的PBS稀释，直至稀释液在734 nm波长处的吸光度值为0.7±0.03，制得ABTS工作液。取100 μL的果酒样加入离心管中，之后加500 μL ABTS工作液，以蒸馏水代替酒样设空白组，以蒸馏水代替ABTS工作液设对照组，以VC溶液为阳性对照组，加ABTS工作液后，充分混匀，反应10 min，测定734 nm波长条件下的吸光度值。每个样品重复3次。样品ABTS+·的清除率计算公式如下：
式中：A1为果酒样组或VC组的吸光度值；A2为对照组吸光度值；A0为空白组吸光度值。
取100 μL的果酒样加入离心管中，与60 μL浓度为0.04 mol/L的H2O2混合后，再加入240 μL 0.1 mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液，以蒸馏水代替酒样设空白组，以蒸馏水代替H2O2设对照组，以VC溶液为阳性对照组，加H2O2后，充分混匀，避光静置10 min，测定230 nm波长条件下的吸光度值。每个样品重复3次。样品OH·的清除率计算公式如下：
式中：A1为果酒样组或VC组的吸光度值；A2为对照组吸光度值；A0为空白组吸光度值。
2 结果与分析
2.1 果胶酶用量对山茱萸果酒澄清度的影响
不同果胶酶添加量对山茱萸果酒澄清效果的影响结果见图1。
图1 不同果胶酶添加量对果酒透光率的影响
Fig.1 Effect of different pectinase addition on thetransmittance of fruit wine
由图1可知，不添加果胶酶时，山茱萸果酒的透光率仅为72.9%。随着果胶酶的添加量在0.01%～0.04%范围内的增大，果酒的透光率不断升高。当果胶酶的添加量＞0.04%时，果酒的透光率增加变缓。当果胶酶的添加量＜0.04%时，由于果胶酶能与底物有效作用，加速了酶促反应，使果酒的透光率增加迅速，当酶的添加量＞0.04%时，酶促反应速率降低，从而导致酶解效果不明显[21]，则使果酒透光率增加缓慢。因此，选用果胶酶的最佳添加量为0.04%。
2.2 酶解温度对山茱萸果酒澄清度的影响
不同酶解温度对山茱萸果酒澄清度的影响结果见图2。
图2 不同酶解温度对果酒透光率的影响
Fig.2 Effect of different enzymatic temperature on the transmittance of fruit wine
由图2可知，随着酶解温度在30～50 ℃范围内的升高，山茱萸果酒的透光率先升高后降低。酶解温度低于40 ℃时，酶活力随着温度升高而增强，当酶解温度高于40 ℃之后，果胶酶的活性反而下降。由于酶是一种蛋白质，随着温度进一步升高，酶发生了变性，导致活性下降。在酶解温度为40 ℃时，透光率最高。因此，选用最适酶解温度为40 ℃。
2.3 酶解时间对山茱萸果酒澄清度的影响
不同酶解时间对山茱萸果酒澄清度的影响结果见图3。
图3 不同酶解时间对果酒透光率的影响
Fig.3 Effect of different enzymatic time on the transmittance of fruit wine
由图3可知，果酒的澄清度随着酶解时间在30～150 min范围内的延长而提高，在60～120 min的酶解过程中，果酒的透光率迅速升高，在120～150 min的酶解过程中，透光率增加幅度缓慢。这是由于当酶解时间＜120 min时，酶解反应较充分，透光率则呈不断上升的趋势；当酶解时间＞120 min之后，底物基本分解完毕，酶解反应也趋于结束，透光率增幅趋缓。因此，选取最佳酶解时间为120 min。
2.4 果胶酶澄清山茱萸果酒工艺优化正交试验结果
澄清工艺优化正交试验结果见表3，正交试验结果的方差分析见表4。由表3可知，以澄清度作为评价指标，根据极差大小结果可知，各因素对山茱萸果酒澄清效果影响的次序为B（酶解温度）＞C（酶解时间）＞A（果胶酶添加量）。从表中的9次试验结果可以直接看出，A2B2C3的透光率最高，为91.6%，而由极差分析得出的最优澄清效果方案为A2B2C2，对这一条件进行验证，测定透光率为92.3%。因此，选取A2B2C2为最佳澄清工艺条件，即果胶酶添加量为0.04%，酶解温度为40 ℃，酶解时间为120 min。由表4可知，酶解温度、酶解时间和酶的添加量皆可显著影响山茱萸果酒的澄清度（P＜0.05）。
表3 澄清工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for clarification process optimization
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
2.5 山茱萸果酒的感官分值、理化指标和微生物指标
在果胶酶最佳澄清工艺条件下，山茱萸果酒呈深红色，有光泽，清亮透明；有典型的山茱萸果香；总体协调柔和，余味悠长；入口柔软平和，无尖涩和苦味，具有独特风格；山茱萸果酒的感官评分为94分。
山茱萸果酒的理化指标如表5所示，所测理化指标均达到相关国标对果酒的要求。
表5 山茱萸果酒的理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physicochemical indicators of dogwood wine
山茱萸果酒微生物指标测定结果：菌落总数＜20 CFU/mL，大肠杆菌群＜3MPN/100mL，致病菌未检出。其微生物指标符合相关国标要求。
2.6 山茱萸果酒的抗氧化活性
山茱萸果酒的抗氧化活性检测结果见表6。由表6可知，其对DPPH·（清除率80.62%）、ABTS+·（清除率82.22%）及OH·（清除率85.07%）均有较好的清除能力。许多果实中因含有多酚类物质而表现出抗氧化活性[22-23]，山茱萸中含有多酚类或环烯醚萜类物质[24]，此两类物质成分具有一定的抗氧化活性，山茱萸中含量较大的成分马钱苷和莫诺苷也具有抗氧化活性[25]，这些活性物质可能在果酒发酵过程中得到很好的保留，所以使得果酒具有很好的抗氧化活性。另据姚瑞祺等[19]报道，山茱萸果酒含有较高浓度的多酚类物质，故其具有很好的抗氧化活性，能有效清除自由基。结果表明，山茱萸果酒具有一定的健康保健作用。
表6 山茱萸果酒的抗氧化活性结果分析
Table 6 Results and analysis of antioxidant activity of dogwoodfruit wine
3 结论
本试验采用果胶酶研究了其山茱萸果酒的澄清效果，通过单因素试验和正交试验对试验条件进行了优化，得出的最佳澄清工艺条件为果胶酶用量0.04%、酶解温度40 ℃、酶解时间120 min，在此最佳酶解工艺条件下，果胶酶的澄清效果明显，透光率达到92.3%，澄清效果明显且感官评分较高。果胶酶的添加量、酶解温度及酶解时间都对山茱萸果酒的澄清效果产生了显著的影响，3种因素对澄清效果的影响顺序为：酶解温度＞酶解时间＞酶添加量。抗氧化活性试验结果还显示，山茱萸果酒（100 mL）对DPPH·、ABTS+·及OH·的清除率分别为80.62%、82.22%和85.07%，表明其具有较好的抗氧化能力和健康促进作用。
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