β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）又称β-D-葡萄糖苷水解酶，首次于1837年由LIEBIG和WOHLER在苦杏仁中发现[1]，其主要水解化合物末端的非还原性β-D-葡萄糖苷键，从而释放出β-D-葡萄糖和配基[2]。β-葡萄糖苷酶有非常广泛的工业应用，可用于降解纤维素生产生物乙醇、改善食品风味、转化大豆异黄酮糖苷化合物、制备低聚龙胆糖、防治病虫害等，具有巨大的生物技术应用前景[3]。尤其是作为香气改良或提升的关键酶，近几年有关其在食品增香中的研究倍受关注[4]。
β-葡萄糖苷酶在酒类（葡萄酒、果酒、白酒等）生产过程中可增加酒的香气[5-6]。目前，所用β-葡萄糖苷酶酶制剂大多来自于曲霉的固态发酵[7]，该酶的加入虽然能改善酒的香气，但同时也给酿酒造成蛋白不稳定隐患[8]。因此，筛选具有β-葡萄糖苷酶活性的酿造酵母，已成为酿酒行业的瓶颈之一。
广东客家娘酒作为我国古老的酒种之一，已有5 000多年的历史，是客家古文化和酒文化相结合的精华，是东南及华南沿海一带（俗称岭南一带），如江苏、浙江、上海、福建、广东等省市客家人独有的民间传统发酵型黄酒[9]。本研究以其为原料，从中筛选产β-葡萄糖苷酶的酿造酵母，采用分子生物学技术对其进行鉴定，并研究其所产的β-葡萄糖苷酶的酶学性质，为筛选具有地区特色产β-葡萄糖苷酶野生酵母提供理论基础，同时，为本地区客家娘酒酿造酵母资源库的建设提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
广东客家娘酒酒糟：广东省梅州市某客家娘酒厂，于-80 ℃保存。
1.1.2 试剂
对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside，p-NPGlc）、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPGal）、对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（4-nitrophenyl-β-D-cellobioside，p-NPCel）、对硝基苯基-β-D-木糖苷（4-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside，p-NPXyl）（均为色谱纯），七叶皂苷（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；酵母基因组提取试剂盒：日本TaKaRa公司；酵母浸粉、胰蛋白胨（均为分析纯）：广东环凯微生物科技有限公司；对硝基苯酚、葡萄糖、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，酵母浸膏10 g/L，121 ℃高压灭菌20 min。
筛选培养基[10]：柠檬酸铁0.5 g/L，酵母膏2 g/L，蛋白胨0.5g/L，琼脂20g/L，七叶苷1g/L，121℃高压蒸汽灭菌20min。
发酵培养基[11]：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏10 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
722N型可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-IF超净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；JY96-IIN超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；H3018DR高速冷冻离心机：上海知信实验仪器技术有限公司；SPX-100B-Z生化培养箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选
初筛：采用七叶苷功能筛选法进行初筛[12]。称取一定质量的酒曲，用无菌生理盐水稀释至适当梯度后，涂布于筛选培养基，28 ℃条件下培养72 h，挑取黑色圈明显的菌株为目标菌株进行复筛。
复筛：将初筛菌株接种于发酵培养基，28 ℃、200 r/min条件下培养72 h，测定β-葡萄糖苷酶活性，从中筛选酶活力较高的菌株[13]。
1.3.2 β-葡萄糖苷酶活性的测定
取发酵液20 mL，5 000 r/min离心5 min，弃上清，收集菌体。将菌体悬浮于10 mL磷酸缓冲盐（phosphate buffer saline，PBS）溶液（pH7.0）中，采用超声波破碎细胞（250 W超声破碎1 min，间歇30 s，破碎30次），4 ℃、10 000 r/min离心，取上清液，即为β-葡萄糖苷酶粗酶液。参考文献[14]并作修改测定β-葡萄糖苷酶活力，具体方法：取0.1 mL适当稀释的粗酶液，加入0.9 mL 5.0 mmol/L p-NPGlc（pH 6.0的Britton-Robinson缓冲液配制），50 ℃恒温水浴反应10 min，加入1 mL 1 mol/L的Na2CO3终止反应，静置5 min，显色，于波长400 nm处测定吸光度值。同时，以加热失活的酶液作为空白对照。
β-葡萄糖苷酶活力单位定义：在pH 6.0、50 ℃反应条件下，每分钟催化水解1 μmol p-NPGlc所需要的酶量为1个酶活力单位（IU）。
1.3.3 产β-葡萄糖苷酶菌株的分子生物学鉴定
采用酵母基因组提取试剂盒提取筛选菌株的基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），以其为模板，参考文献[15]对菌株的26S rDNA D1/D2区序列进行PCR扩增。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）网站的GenBank数据库中进行BLAST搜索比对，分析序列同源性。选取同源性较高的模式菌株的26S rDNA D1/D2区基因序列，采用MEGA X10软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树。
1.3.4 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究
底物特异性[16]：以p-NPGlc、p-NPGal、p-NPCel和p-NPXyl为底物，测定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。
最适反应温度：在25～70 ℃条件下测定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。
温度稳定性：将粗酶液分别置于25～70 ℃条件下恒温水浴120 min，迅速冷却至室温，测定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。
最适反应pH值：在pH值为3.0～8.0条件下测定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。
pH稳定性：将粗酶液分别在pH值为3.0～8.0条件下室温静置1 h，测定β-葡萄糖苷酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力。
金属离子对酶活性的影响：在反应体系中添加1 mmol/L或100 mmol/L的金属离子（Ca2+、Mn2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Fe2+、Ni+、K+、Al3+、Cu2+），测定β-葡萄糖苷酶的活力，以不含金属离子的酶活力为100%，计算相对酶活力。
1.3.5 数据处理
所有数据用SPSS24.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 产β-葡萄糖苷酶酵母菌株的筛选
以广东客家娘酒发酵过程中的酒糟为分离源，通过七叶苷功能筛选法，初步筛选出β-葡萄糖苷酶活力较高的酵母18株，部分菌株的筛选结果见图1。
图1 产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选结果
Fig.1 Screening results of β-glucosidase producing strain
由图1可知，具有β-葡萄糖苷酶活力的菌株会呈现黑色，黑色圈越大或出现越早则意味着菌株酶活力较高。然后通过复筛，得到β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株，命名为kj_312，酶活力达到56.2 IU/L。因此，以该菌株作为试验菌株进行下一步的研究。
2.2 26S rDNA D1/D2区基因序列分析
将菌株kj_312的26S rDNA D1/D2区基因序列与Gen-Bank数据库中已鉴定的酵母的26S rDNA D1/D2区序列进行同源性比对，选取同源性较高的模式菌株的26S rDNA D1/D2区基因序列，采用MEGA X10软件中的NJ法构建系统发育树，结果见图2。
图2 基于26S rDNA D1/D2区序列的产β-葡萄糖苷酶菌株的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of β-glucosidase producing strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequence
由图2可知，菌株kj_312与假丝酵母Candida apicola AN16聚于一支，亲缘关系最近。因此，初步鉴定该菌株为假丝酵母Candida apicola。
2.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质
2.3.1 底物特异性
由图3可知，该β-葡萄糖苷酶可以水解p-NPGlc、p-NPCel、p-NPGal和p-NPXyl，其中以p-NPGlc为底物时，相对酶活力最高，其次为p-NPCel和p-NPGal。表明假丝酵母kj_312所产的β-葡萄糖苷酶具有较宽的底物特异性，能够水解多种底物，属于多功能酶[17-18]，且其最适底物为p-NPGlc。
图3 菌株kj_312所产β-葡萄糖苷酶的底物特异性
Fig.3 Substrate specificity of β-glucosidase produced by strain kj_312
2.3.2 最适反应温度及温度稳定性
图4 菌株kj_312所产β-葡萄糖苷酶的最适反应温度及温度稳定性
Fig.4 Optimal reaction temperature and temperature stability of β-glucosidase produced by strain kj_312
由图4可知，在反应温度25～60 ℃范围内，β-葡萄糖苷酶活力随着温度的升高而升高；当反应温度为60 ℃时，酶活性达到最高；当温度高于60 ℃之后，酶活力呈现缓慢下降趋势。因此，确定β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃。当粗酶液在温度25～75 ℃范围内恒温水浴120 min，酶活力随着处理温度的升高逐渐下降，当处理温度为65 ℃时，相对酶活性为64%；当处理温度高于65 ℃之后，相对酶活力＜50%，说明β-葡萄糖苷酶在25～65 ℃具有较好的稳定性。与其他酵母来源的β-葡萄糖苷酶[8，19]比较，本研究假丝酵母kj_312所产的β-葡萄糖苷酶具有较广的温度适应性。
2.3.3 最适反应pH值及pH稳定性
目前很多研究表明，绝大多数β-葡萄糖苷酶的最适pH值在3.5～5.5范围内，适宜于酿酒环境介质中应用[8，20]。由图5可知，假丝酵母kj_312所产的β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值为4.5，并且在pH值4.0～7.0酸性范围内相对酶活力＞80%，表现出较高的pH稳定性。结果表明，该β-葡萄糖苷酶能极大地满足在酿酒期间的pH要求，为该菌株在酿酒中的应用提供了依据。
图5 菌株kj_312所产β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值及pH稳定性
Fig.5 Optimal reaction pH and pH stability of β-glucosidase produced by strain kj_312
2.3.4 金属离子对β-葡萄糖苷酶活性的影响
表1 不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活性的影响
Table 1 Effect of metal ions on β-glucosidase activity
由表1可知，金属离子种类及浓度对酶活性的影响不同。在1 mmol/L浓度下，Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+使相对酶活力分别提高至140%、136%、113%和176%，其余金属离子则使相对酶活力降至56%～87%；而在100 mmol/L浓度下，Ca2+、Zn2+和Fe2+使相对酶活力提高至218%、201%和232%，Mg2+使相对酶活力降低至56%，Mn+、Co2+、Ni2+、Na+、K+、Al3+和Cu2+则使β-葡萄糖苷酶完全失活。
3 结论
从广东客家娘酒发酵过程中的酒糟中筛选得到1株产β-葡萄糖苷酶活力较高的酵母菌，命名为kj_312，经26srDNA D1/D2区基因序列分析，鉴定其为假丝酵母Candida apicola。酶学性质研究表明，该酵母所产的β-葡萄糖苷酶具有较宽的底物特异性，对多种底物较具有高的催化活性，最适底物为对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷；最适反应温度为60 ℃，在25～65 ℃范围内相对酶活力＞50%；最适pH值为4.5，在pH 4.0～7.0酸性范围内相对酶活力＞80%；1 mol/L的Ca2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+及100 mol/L的Ca2+、Zn2+和Fe2+能显著提高酶活力。
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