猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）又称狐狸桃、藤梨、羊桃、奇异果、麻藤果等，为落叶木质藤本植物。具有抗氧化[1-3]、降血压[4]、预防癌症[5]、提高免疫力[6-8]、促消化[9-10]、抗炎和抗病毒[11-12]等功效。
苹果梨（Pyrus ussuriensis var ovoidea）为蔷薇科梨属果树的果实，是北方寒温带地区主要果品之一，原产于吉林省延边朝鲜族自治州。具有润肺止咳[13-14]、清热解毒[15]、利尿[16]、软化血管[17-18]、止吐止泻[19]、抗氧化[20]等功效。
中国是亚洲地区重要的果酒生产和消费国，2018年苹果酒、梨酒和米酒产业收益为141.50亿欧元，预计未来3年年均增长率达2.2%，人均果酒消费量可达到1.7 L[21]。中国果酒具有很大的市场潜力，复合果酒以其独特的风味及口感备受消费者青睐，近年来关于复合果酒的口味多样化、营养强化以及发酵条件的优化等成为我国从事果酒加工人员的关注焦点。王静等[22]研究了猕猴桃酒发酵过程中营养成分变化及发酵方式对成品酒品质的影响进行了分析，李爱华等[23]利用混合酵母发酵对刺葡萄酒香气成分气味活性的调整作用进行了分析。本试验以猕猴桃和苹果梨为原料，利用单因素试验结合正交试验，优化复合果酒发酵工艺条件，以期为复合果酒的产业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
猕猴桃：陕西省宝鸡市；苹果梨：吉林省延吉市；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；壳聚糖（食品级），1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：国药集团化学试剂有限公司；白砂糖（优级）：吉林省杞参食品有限公司；Na2SO3（分析纯）：天津市东丽区天大化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
LH-T032型糖度计：杭州陆恒生物科技有限公司；SPX-25085-11型生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；722型紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；OHG-924385-III型电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 猕猴桃苹果梨复合果酒加工工艺流程及操作要点
混合果汁的制备：猕猴桃、苹果梨去皮，切分后分别加入3倍质量的水，并添加90 mg/L Na2SO3护色，用料理机破碎榨汁，0.4‰果胶酶45 ℃酶解1 h，四层纱布过滤。
加入一定比例已经活化的酵母菌，24 ℃恒温发酵，在主发酵过程中根据观察排气。
成分调整：将两种果汁充分混合，加入适量的白砂糖，制得发酵体系。
酵母活化：将0.4 g酵母菌加入50 mL 5 g/L的白砂糖溶液中，30 ℃活化25 min，得酵母菌活化液。
主发酵：在发酵体系中添加一定量的酵母活化液，一定条件下进行发酵。在主发酵过程中根据观察排气及温度变化，当无气体产生，温度接近设置温度，提示主发酵结束。
后发酵：主发酵结束后，采用虹吸法将酒液倒入另一发酵容器中，密闭防止氧化，温度14 ℃，静置发酵15 d。
澄清：后发酵结束后，加入0.6mg/mL的壳聚糖澄清24h。
陈酿：同样采用虹吸方法将上层澄清酒液转入另一灭菌后的发酵容器中，密封放在0～5 ℃的环境中存放2个月。
1.3.2 猕猴桃、苹果梨果汁混合比例的确定
以感官评定为考察指标，分别研究猕猴桃汁与苹果梨汁体积比为2∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶2（V/V）对猕猴桃苹果梨酒发酵的影响。
1.3.3 猕猴桃苹果梨复合果酒发酵条件优化单因素试验
猕猴桃苹果梨酒发酵单因素试验：以感官评定为考察指标，分别研究初始糖度（16%、18%、20%、22%、24%、26%）、发酵温度（18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃）、酵母接种量（0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.30 g/L）、发酵时间（4 d、5 d、6 d、7 d、8 d）对猕猴桃苹果梨发酵酒的影响。
1.3.4 猕猴桃苹果梨发酵条件优化正交试验
在单因素试验的基础上，分别以初始糖度、酵母接种量发酵温度以及发酵时间为变量因子进行正交试验，以感官评定为考察指标，确定猕猴桃苹果梨复合果酒的最佳发酵条件，正交试验因素与水平见表1。
表1 猕猴桃苹果梨复合果酒发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
1.3.5 测定方法
酒精度：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法检测。
感官评价：选取40名品评员，其中包括20名长期从事果酒加工的专业人员，另外20名为从事其他食品方面人员（其中20～30岁、30～40岁、40～50岁、50～60岁、60～70岁各4名）。食品专业人员权重0.6，非专业人员权重0.4，满分100分，感官评分标准见表2。
表2 猕猴桃苹果梨复合果酒感官指标评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
抗氧化能力的测定：采用参考文献[13]的方法测定，准确称取一定量的DPPH，用乙醇溶解并稀释至吸光度值为0.7，将试样和3 mL DPPH溶液混匀，避光放置30 min，在波长517 nm处测定吸光度值，同时作空白对照，计算DPPH自由基清除率。
总还原能力的测定：取2.5 mL酒液放入试管中，依次加入pH为6.7的2.0 mL磷酸盐缓冲溶液，2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液，于50 ℃保温20 min，冷却后加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min离心10 min，取2.5 mL上清液，依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，混合均匀，反应10 min，在波长700 nm处测定吸光度值[24]。以吸光度值反映其总还原能力，吸光度值越大，表明其总还原能力越强。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃苹果梨果汁混合比例对发酵酒品质的影响
由图1可知，感官评分随着猕猴桃汁量的增大呈现出先上升后下降趋势，当猕猴桃汁和苹果梨汁比为1∶1时达到最高，感官评分为95分。猕猴桃汁和苹果梨比例大于1∶1时感官评分偏低。原因是猕猴桃含酸量较高，果酒酵母的耐酸能力较强，发酵液pH为3.5～4.5时，果酒酵母能够正常活动，细菌及其他绝大多数杂菌受到抑制，当pH＜3.5时果酒酵母活力下降。因此，猕猴桃汁和苹果梨汁比最佳选择为1∶1。
图1 猕猴桃苹果梨汁比例对猕猴桃苹果梨复合果酒品质的影响
Fig.1 Effect of mixed proportion of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis juice on quality of A.chinensis and P.ussuriensis compound wine
2.2 初始糖含量对发酵品质的影响
图2 初始糖度对猕猴桃苹果梨复合果酒品质的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content on quality of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
由图2可知，发酵酒的感官评分随着初始糖度的增加呈先上升后下降的趋势。当初始糖度为24%时感官评分为88分，发酵酒具有猕猴桃的香味和醇厚的酒香，但当初始糖度提高，感官评分降低，剩余的残糖过多，口感偏甜。因此，选择最佳初始糖度为24%。
2.3 酵母接种量对发酵酒品质的影响
图3 酵母接种量对猕猴桃苹果梨复合果酒品质的影响
Fig.3 Effect of yeast addition on quality of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
由图3可知，发酵酒感官评分随着随着酵母接种量的增加开始呈上升趋势之后基本保持不变。当酵母接种量为0.25 g/L时，感官评分为89分，发酵酒具有猕猴桃香味和醇厚的酒香，当酵母接种量大于0.25 g/L感官评分变化不明显，发酵体系中提供酵母的营养基质含量是一定的，过量的酵母并不能提高发酵酒的酒精度，同时也会增加成本。因此，选择最佳酵母接种量为0.25 g/L。
2.4 发酵温度对发酵酒品质的影响
图4 发酵温度对猕猴桃苹果梨复合果酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on quality of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
由图4可知，发酵酒的感官评分随发酵温度的增加开始时期呈逐渐增加趋势，随后开始下降，当发酵温度为22 ℃时，感官评分为91分，发酵酒具有淡淡的猕猴桃香味和醇厚的酒香。在发酵过程中温度升高，发酵周期缩短，当温度超过22 ℃时，酵母菌生长受到抑制，酒精度和感官评分均下降。因此，选择最佳发酵温度为22 ℃。
2.5 发酵时间对发酵酒品质的影响
图5 发酵时间对猕猴桃苹果梨复合果酒品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on quality of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
由图5可知，发酵酒的感官评分随着发酵时间的增加先上升之后保持不变。当发酵时间为6 d时感官评分为95.7分。发酵酒具有猕猴桃香味和酒香。因此，最佳发酵时间为6 d。
2.6 猕猴桃苹果梨复合果酒工艺条件优化
在单因素试验的基础上，以初始糖度、酵母接种量、发酵温度、发酵时间为影响因子，发酵酒的感官评分为考察指标，采用正交试验分析法结合感官评定，确定最佳的发酵工艺条件，试验结果如表3。
表3 猕猴桃苹果梨复合果酒发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
从极差分析可知，影响猕猴桃苹果梨复合果酒发酵效果的因素依次为B＞D＞C＞A，即影响猕猴桃苹果梨复合果酒发酵的因素依次是酵母接种量、发酵时间、发酵温度、初始糖度。最佳发酵工艺为A1B3C3D2，即初始糖度为22%，发酵温度为24 ℃，酵母接种量为0.30 g/L、发酵时间为7 d。在此条件下感官评分为96分。
2.7 猕猴桃苹果梨复合果酒体外抗氧化能力的测定
比较发酵前后，澄清前后对猕猴桃苹果梨酒的DPPH的清除能力及总还原能力，结果见表4。
表4 猕猴桃苹果梨复合果酒的DPPH自由基清除率
Table 4 DPPH radical scavenging rate of Actinidia chinensis and Pyrus ussuriensis compound wine
猕猴桃中含有表儿茶素、没食子酸、绿原酸和儿茶素，苹果梨中含有绿原酸、儿茶素和槲皮素等活性成分具有抗氧化性，通过表4可知，通过发酵能够提高清除DPPH的能力，说明猕猴桃和苹果梨经过发酵可能使活性物质增加，或者经过发酵转化成具有清除DPPH的活性物质。但是经过澄清后，清除DPPH的能力略有下降，总还原能力略下降，说明可能是壳聚糖吸附了部分酚类物质。
3 结论
试验通过单因素试验和正交试验得出猕猴桃苹果梨的最佳发酵条件为初始糖度为22%，发酵温度为24 ℃，酵母接种量为0.30 g/L、发酵时间为7 d；经发酵过程猕猴桃苹果梨复合果酒抗氧化能力增强，澄清后DPPH自由基清除率为76.40%，总还原能力为0.49。
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