黑糖营养价值高，可以益气、温经散寒、缓解疼痛、补充钙质和铁质，尤其是黑糖中含有的多糖具有较强的抗氧化和抗衰老功效[1]。红茶中含有类黄酮、茶多酚和脂多糖等多种活性成分，具有降低血脂、抑制动脉硬化、抗肿瘤、预防癌症和防治神经性疾病等功能[2]。红茶品性温和、汤色红艳、养胃护胃，非常适合女性饮用；红茶文化及红茶保健功能越来越受到人们关注，但我国女性饮茶比例远低于男性，开发含红茶又适合女性食用的饮品极有意义。罗惠波等[3]以红茶和小曲酒为主要原料，研制出具有红茶和小曲酒典型香气且色泽艳丽、口感绵柔的红茶酒。糯米甜酒营养物质丰富，含有多种氨基酸、有机酸、维生素、钙、磷、铁等。甜米酒因其酒精度较低，糖度较高，口感醇厚，营养成分更易于人体吸收，对孕产妇和身体虚弱的妇女具有补气养血，滋阴补肾的功效，是一种非常适合女性饮用营养保健型饮料酒[4-8]。鲁永强等[9]以糯米为原料，经糖化和发酵等工序，制成醇甜爽口、酸度适宜、风味和营养兼具的糯米甜酒酿。林巧[10]以苦荞米、糯米和安琪甜酒曲为原料，采用传统工艺酿制苦荞糯米甜酒，感官评分为92.67分。随着生活水平日益提高，人们对酒的品质追求越来越高，尤其是女性和老年消费者更倾向于饮用健康保健酒，所以具有较高营养价值和保健功效的酒越来越受欢迎。
本研究以糯米、黑糖和红茶为主要原辅料，以甜酒曲和酿酒曲为发酵剂，通过单因素和正交试验以及响应面分析法，研究复合发酵型黑糖红茶甜米酒的最佳发酵工艺，确定黑糖红茶汤制备、发酵剂添加量、发酵温度和发酵时间等发酵工艺参数。研制甜米酒、黑糖和红茶三者优点兼具的新产品—复合发酵型黑糖红茶甜米酒，针对女性受众，填补市场空白，具有广阔市场前景。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
优质糯米、云南黑糖、红茶叶、安琪甜酒曲、安琪酿酒曲：广西来宾市沃尔玛超市；酒石酸钾钠、硫酸铜、葡萄糖、亚铁氰化钾（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FA2004B电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；CFXB130-A蒸饭锅：广东龙力电器有限公司；DHP-9082电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HH-S6数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；C21-ST2125电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司；H3-20KR台式高速冷冻离心机：湖南可成仪器设备有限公司；雷磁PHS-3E pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；LH-J80酒精度测定仪：杭州陆恒生物科技有限公司；HSU-32手持糖度计：上海精密仪器仪表有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 复合发酵型黑糖红茶甜米酒工艺流程及操作要点
操作要点：
黑糖红茶汤制备：先将红茶叶粉碎，可提高浸提效率，为防止浸提液浑浊，可将粉碎后的红茶叶装入滤袋。加入适量比例经灭菌后的饮用水，用超声波辅助浸提适当时间后过滤得红茶汤，过滤的茶渣还可二次浸提。将适量比例的黑糖溶解于红茶汤中，即制备得黑糖红茶汤。
糯米淘洗浸泡：糯米经过筛后除去石子等杂质和半粒米，用饮用水将糯米淘洗2～3次，然后把淘洗干净的糯米在室温条件下用水浸泡5 h左右，使之浸泡后完整而酥[11]，压撵后可成粉状。
蒸饭：将浸泡好的糯米沥干水，在蒸屉中铺上纱布，将糯米均匀铺在纱布上，厚度要适度，用蒸柜蒸煮30 min左右，确保糯米熟透且米粒软硬适度。
淋饭：将灭菌后冷却的黑糖红茶汤淋在蒸好的糯米饭上，有助于快速冷却，米饭在降温的同时也增加其含水量，有利于进行拌曲。
接种（拌曲）：糯米饭晾凉至35 ℃以下时，将甜酒曲和活化后的酿酒酵母均匀撒在米饭上，将米饭反复多次翻拌，但注意保持米粒形态完好，使甜酒曲和酿酒酵母均匀分布在米饭中，达到拌曲均匀。
搭窝糖化：酒曲拌匀后，将米饭转移到发酵罐中，边放边用手掌轻轻将米饭压实，做成平顶的圆锥型，并用手掌或工具将米饭表面抹一抹，使表面光滑，然后在米饭上部中间掏挖一个凹陷窝（又称搭窝），其目的是为了增加米饭和空气的接触面积，有利于好气性糖化菌生长繁殖，又便于观察，用纱布进行封口，于30 ℃恒温箱中糖化2 d左右[12]。
密封发酵：糖化后按生米质量约1∶1加入灭菌后的饮用水，密封恒温发酵。主发酵后再经缓慢后发酵，残留的淀粉和糖分继续糖化发酵，然后转化为酒精，酒精度逐渐增加，伴随着各类酯类物质的生成，发酵成熟后，酒的香气物质不断增加，使酒体更趋于醇厚丰满，且香气浓郁。
过滤：依次采用3 mm、2 mm、1 mm、0.5 mm、0.25 mm五级筛网进行过滤。
离心澄清：采用转速3 000 r/min以上，离心5 min左右，取上清液灌装。
罐装灭菌：用金属盖的玻璃瓶灌装，采用高温灭菌。
陈酿：糖化和发酵过程中形成的各种酯类香气物质、乙醇和糖类物质等相互融合，使甜米酒进一步成熟，使酒卤芳香、甜醇粘郁。
成品：制成罐装黑糖红茶甜米酒成品，在低温条件贮藏。
1.3.2 感官评定方法
由10名经过培训的人员组成感官品评小组，参考NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》感官要求[13]，根据黑糖红茶汤和复合发酵型黑糖红茶甜米酒的形态、色泽、气味、滋味、杂质等进行评分。感官评分满分为12分，分别参照表1、表2请10位评价员对样品按评分检验法进行感官评分[14]，10人对每个样品评分的平均值记为该样品最终得分，以平均得分为评判标准。
表1 黑糖红茶汤感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of brown sugar and black tea soup
表2 复合发酵型黑糖红茶甜米酒品质感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards of compound fermented brown sugar and black tea sweet rice wine quality
1.3.3 主要理化与卫生指标检测方法
酒精度采用蒸馏比重法进行测定[4]；还原糖、总酸、大肠菌群、致病菌参照NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》中推荐的方法检测。
1.3.4 黑糖红茶汤制备工艺优化
（1）单因素试验
分别选取黑糖添加量为8%、10%、12%、14%、16%，红茶添加量为6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%，超声波功率为120 W、150 W、180 W、210 W、240 W，浸提温度为80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃，浸提时间为3 min、6 min、9 min、12 min、15 min，设计单因素试验。
（2）正交试验
根据单因素试验结果，以感官评分为考察指标，选取黑糖添加量（A）、红茶添加量（B）、超声波功率（C）、浸提温度（D）、浸提时间（E）5个因素的3个水平，采用L18（35）设计正交试验。正交试验因素与水平见表3。
表3 黑糖红茶汤制备工艺优化正交试验因素与水平
Table 3 Factors and levels of orthogonal tests for preparation technology optimization of brown sugar and black tea soup
1.3.5 复合发酵型黑糖红茶甜米酒的发酵工艺优化
（1）单因素试验
糯米与黑糖红茶汤料液比为1∶1（g∶mL），以感官评分为评判标准，分别研究各单因素对复合发酵型黑糖红茶甜米酒的影响。初始条件分别取：甜酒曲添加量0.4%、酿酒曲添加量0.25%、发酵温度30 ℃、发酵时间3 d。选取各因素变量分别为甜酒曲添加量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、酿酒曲添加量（0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%）、发酵温度（28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃）、发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d），进行单因素试验。
（2）响应面法优化试验[15-16]
在单因素试验基础上，选择以甜酒曲添加量（X1）、酿酒曲添加量（X2）、发酵温度（X3）和发酵时间（X4）为自变量，复合发酵型黑糖红茶甜米酒感官评分（Y）为响应值，采用Design-Expert V8.0.6进行Box-Behnken设计，Box-Behnken试验因素与水平编码见表4。
表4 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 4 Factors and levels of Box-Behnken tests design
2 结果与分析
2.1 黑糖红茶汤制备工艺优化正交试验
在单因素试验基础上，选取黑糖添加量（A）、红茶添加量（B）、超声波功率（C）、浸提温度（D）、浸提时间（E）5个因素，以感官评分为考察指标，采用L18（35）设计正交试验。正交试验结果与分析见表5。
表5 黑糖红茶汤制备工艺优化正交试验结果与分析
Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for preparation technology optimization of brown sugar and black tea soup
续表
由表5可知，各因素对黑糖红茶汤质量影响的主次顺序为B＞A＞C＞E＞D，红茶添加量和黑糖添加量是主要影响因素，其次是超声波功率和浸提时间，浸提温度影响最小。正交试验所得黑糖红茶汤制备最优工艺条件为A2B2C2D2E2，即黑糖添加量为14%，红茶添加量6.5%，超声波功率180 W，浸提温度85 ℃，浸提时间12 min，在此最佳制作工艺条件下进行3次平行验证试验，黑糖红茶汤感官评分为11.3分。
2.2 黑糖红茶甜米酒发酵工艺优化
2.2.1 单因素试验结果与分析
图1 各单因素对黑糖红茶甜米酒感官品质的影响
Fig.1 Effect of each single factor on the sensory quality of brown sugar and black tea sweet rice wine
由图1可知，在甜酒曲添加量为0.2%～0.6%范围时，黑糖红茶甜米酒感官评分随着甜酒曲添加量的增加先增大后减少，当甜酒曲添加量为0.4%时，黑糖红茶甜米酒的感官评分最高，为11.0分，其后随着甜酒曲添加量的增加，黑糖红茶甜米酒的评分呈现缓慢下降，因此确定最佳甜酒曲添加量为0.4%。在酿酒曲添加量为0.15%～0.35%范围时，随着酿酒曲添加量的增加，黑糖红茶甜米酒感官评分呈先增加后降低的趋势，当酿酒曲添加量为0.25%时，黑糖红茶甜米酒的感官评分最高，为9.9分；酿酒曲中含有大量酵母，酵母生长繁殖会产生淀粉酶、糖化酶等，可降解淀粉成葡萄糖，并分解蛋白质成氨基酸；当酿酒曲添加量过少时，糖化速度较慢，发酵周期延长，易导致杂菌污染；当酿酒曲添加量过多时，发酵反应过快，酒精度快速升高，从而过早抑制发酵菌活性；因此确定最佳酿酒曲添加量为0.25%。在发酵温度为28～32 ℃范围时，黑糖红茶甜米酒感官评分随着发酵温度的上升先增高后降低，在发酵温度30 ℃时，感官评分最高，为10.2分，发酵温度＞30 ℃后感官评分下降，主要原因是温度过高不利于酵母生长繁殖，造成发酵后期发酵力下降，糖分残留过多，酒精度偏低[17]，也不利于风味物质的形成和积累，导致酒的口感滋味不佳，因此确定最佳发酵温度为30 ℃。在发酵时间为1～5 d范围时，发酵时间＜3 d时，感官评分随发酵时间延长而明显增高，在发酵时间为3 d时，感官评分最高，为10.9分，随着发酵时间继续延长，感官评分呈现缓慢下降，原因可能为过度发酵导致菌体自溶，细菌将部分酒精转化为有机酸，酸度增加导致酒口感滋味下降，因此确定最佳发酵时间为3 d。
2.2.2 响应面法试验结果与分析
在单因素试验基础上，选择以甜酒曲添加量（X1）、酿酒曲添加量（X2）、发酵温度（X3）和发酵时间（X4）为自变量，复合发酵型黑糖红茶甜米酒感官评分（Y）为响应值，采用Design-Expert V8.0.6进行Box-Behnken设计，Box-Behnken试验结果见表6，方差分析结果见表7。
表6 Box-Behnken试验设计及结果
Table 6 Design and results of Box-Behnken tests
表7 回归方程方差分析
Table 7 Variance analysis of regression equation
注：“***”表示差异高度显著（P＜0.000 1）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）。
采用Design-Expert 8.0.6软件对表6的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到甜酒曲添加量、酿酒曲添加量、发酵温度、发酵时间的二次多项式回归方程为[18]：
由表7可知，试验模型F值为46.07，P＜0.000 1，说明模型高度显著。根据F值大小判断各因素对试验结果影响的主次顺序依次为：X4＞X3＞X2＞X1，即发酵时间＞发酵温度＞酿酒曲添加量＞甜酒曲添加量。一次项X1、X2对黑糖红茶甜米酒感官评分影响不显著（P＞0.05），X3、X4对黑糖红茶甜米酒感官评分影响分别为极显著（P＜0.01）和高度显著（P＜0.000 1）；交互项X3X4和二次项X12、X22、X32、X42对黑糖红茶甜米酒感官评分的影响分别为显著（P＜0.05）和高度显著、极显著性、极显著性、高度显著，其他单因素和两两因素交互作用对响应值（感官评分）影响均不显著。表明4个试验因素对响应值的影响并非仅呈现出一次函数线性关系，还表现出二次函数关系[19-21]。
此模型相关系数R2=0.978 8，而且失拟项P值=0.071 9＞0.05，表明回归方程拟合程度好，预测值与真实值之间具有高度相关性，该模型可以应用于理论预测。经软件分析预测，甜酒曲添加量0.4%、酿酒曲添加量0.25%、发酵温度29.7 ℃、发酵时间3.15 d，此发酵工艺条件下感官评分预测值为11.18分。在此工艺条件下进行3次验证试验，制得的黑糖红茶甜米酒感官评分实际值为11.10分，与预测值相差不大，表明经响应面法分析建立的回归方程模型可行。结合表6试验结果并方便实际操作，将最佳发酵工艺条件确定为甜酒曲添加量0.4%、酿酒曲添加量0.25%、发酵温度30 ℃、发酵时间3 d。
图2 各因素交互作用对黑糖红茶甜米酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score of brown sugar and black tea sweet rice wine
2.3 黑糖红茶甜米酒品质分析
黑糖红茶甜米酒感官评分为11.1分；酒精度10.7%vol；还原糖（以葡萄糖计）8.1 g/100 g；总酸（以乳酸计）0.5 g/100 g。大肠菌群：未检出；致病菌：未检出。
3 结论
在单因素试验的基础上，经正交试验优化及验证，黑糖红茶汤制备最优工艺条件为：黑糖添加量为14%，红茶添加量6.5%，超声波功率180 W，浸提温度85 ℃，浸提时间12 min。在单因素试验的基础上，经响应面法优化及验证，黑糖红茶甜米酒最佳发酵工艺条件为：甜酒曲添加量0.4%、酿酒曲添加量0.25%、发酵温度30 ℃、发酵时间3.0 d。该产品生产工艺简单，酒精度较传统糯米甜酒高，黑糖和红茶风味与香气较突出，具有一定特色和创新性。
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