苦荞（Fagopyrum tataricum）为药食同源类粮食作物[1]，属蓼荞麦属，自古以来，被民间称为“净肠草”。苦荞味苦，性平寒，具有益气续神、祛积化滞、利耳安神、止咳平喘、活血宽肠、减肥美容等功效。其含有黄酮、多种氨基酸、微量元素、维生素以及多酚、膳食纤维等功能活性物质。黄酮类化合物具有多重生理功能，在改善非特异性免疫功能的同时[2]，还能抑制粥样动脉硬化，达到降血脂、改善脂代谢的功效[3]。苦荞中的黄酮类化合物可提高超氧化物歧化酶活性，从而降低丙二醛的含量，达到抗衰老、增强活力的目的[4-5]。黄酮中的芦丁还有防止脑细胞老化、作抗癌药物[6-7]、抑制疼痛等作用，其镇痛作用强于阿司匹林[8-9]。
食醋味酸而醇厚，液香而柔和，富含氨基酸，具有生津止渴、改善食欲的功效[10]，食醋中的醋酸、乳酸、苹果酸和琥珀酸等多种有机酸，能有效促进肝脏排毒，减少肝病发生的机率，是烹饪时一种不可或缺的调味品[11]。此外，食醋还有利尿、防结石护肾等作用。
在以苦荞为原料酿制苦荞醋的过程中，黄酮损失较大，降低了苦荞醋的保健功能；且苦荞中的多糖含量高，导致发酵过程中发酵液黏稠，影响发酵液中部分酶的活性，不利于发酵的进行，导致产率不高品质下降。因此，本研究将提取过多糖、黄酮的苦荞粉酿制成苦荞醋，再将所提取的黄酮添加到苦荞醋中，探究苦荞破碎度、糊化与否、糖化时蛋白酶添加等条件对苦荞粉酿醋的影响，以期达到提高苦荞醋黄酮含量，改善操作性能的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
苦荞：贵州师范大学试验基地；醋酸菌：由贵阳味莼园食品股份有限公司提供；活性安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；小麦、高粱：市售。
1.1.2 主要试剂
芦丁标准品（纯度＞98%）：贵州迪大生物科技有限责任公司；硫酸：重庆川东化工（集团）有限公司；重铬酸钾、苯酚、硫酸亚铁铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硝酸钠：天津市永大化学试剂有限公司；硝酸铝、乳酸：天津市密欧化学试剂有限公司；石油醚（沸程为60～90 ℃）：天津市富宇精细化工有限公司；碘化钾、碘：天津市北辰方正试剂厂；甲基红：天津市化学试剂有限公司；乙酸锌：天津市优谱化学试剂有限公司；硫代硫酸钠、甲醛溶液、硫酸铜、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾：成都金山化学试剂有限公司；柠檬酸、乙酸钠：重庆茂业化学试剂有限公司；盐酸、丙酮：重庆川东化工（集团）有限公司；1,10-邻菲啰啉、三氯乙酸、L-酪氨酸：上海展云化工有限公司；酪蛋白、酸性蛋白酶（5 700 U/g）、中性蛋白酶（1 2000 U/g）、碱性蛋白酶（4 000 U/g）、α-淀粉酶酶活（4 000 U/g、糖化酶（3 700 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；高峰氏淀粉酶：上海沪宇生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
101-1电热干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；HH-b型数显恒温水浴锅：常州奥华仪器有限公司；FA2004N精密电子天平：上海菁海仪器有限公司；SPX-250生化培养箱：上海恒丰仪器仪表有限公司；THZ-92C 台式恒温振荡器：上海浦东物理光学仪器厂；721型可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；pHS-3C 数显酸度仪、上海虹益仪器仪表有限公司；Vaco 5-II-D真空冷冻干燥机：ZiRBUSTechnology GmbH。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
1.3.2 操作要点
苦荞黄酮提取：在温度60 ℃，酒精含量60%vol的条件下，超声辅助提取30 min，料液比1∶50，黄酮提取液于65 ℃旋转蒸发直至乙醇全部蒸干后低温鼓风干燥备用。
水提苦荞多糖：提取温度70 ℃，超声辅助提取50 min，料液比1∶25，多糖的提取液真空冷冻备用；滤过的苦荞粉在60 ℃干燥，打散，备用。
粉碎及原料配比：苦荞粉碎15 s，取＞40目苦荞粉160 g，活性干酵母0.5 g，食盐5 g，醋酸菌种子液96 mL，料水比1∶4。
糊化：沸水浴15min。
液化：调pH为6.5，按0.15%加入α-淀粉酶（最适温度55～65 ℃），于60 ℃水浴锅中液化2.5 h。
糖化：调节pH为5.0，按1.5%加入糖化酶，于60 ℃水浴锅中糖化3 h，调节pH至4.5备用。
酒精发酵：称取发酵液质量0.1%的活性干酵母，置于5%的蔗糖溶液中，配制成10 g/100mL的酵母活化液，在30 ℃活化30 min后加入制备好的糖化醪中。用保鲜膜封口后，28 ℃条件下发酵3 d开始测发酵液酒精度，直至发酵液澄清、无气泡产生、酒精度不再上升，取出酒醪过滤，调节酒精度为6%vol。
醋酸发酵：按酒醪体积的12%加入醋酸菌种子液，装液量25%，在29 ℃的培养箱中培养，从接种当天开始，每天取醋液测总酸含量，当总酸含量开始下降，立即加盐结束发酵。
添加黄酮：将提取的黄酮添加到苦荞醋中后充分混匀，静置1 h后经过滤得半成品，再经调配后得到苦荞醋成品。
1.3.3 单因素优化试验
粉碎度对糖化效果的影响：将粉碎15 s的苦荞粉用不同目数的筛子进行筛选，分别取未过筛、20～40目、40～60目、60～80目、≥80目的苦荞粉各10 g，制成糖化醪液，测还原糖含量。
糊化对发酵的影响：分别用提取黄酮、多糖的苦荞粉及原粉（未提取黄酮、多糖的苦荞粉）160 g按料水比1∶4（g∶mL）（发酵液体积为800 mL），按沸水浴糊化和不糊化共四种（以下简称“提”、“提糊”、“未提”、“未提糊”）处理后进行酒精发酵和醋酸发酵，除糊化过程外其他工艺均与操作要点相同，分别测定每个阶段发酵液的还原糖、酒精等的含量及酒精发酵后的上清液体积。
蛋白酶的添加对发酵的影响：取＞40目提取多糖黄酮的苦荞粉和原粉各100 g，加水比1∶4（g∶mL），分别在糖化前、后添加酸性蛋白酶（2.5%）、中性蛋白酶（1.3%）、碱性蛋白酶（0.4%），进行发酵，以不添加蛋白酶为空白对照，测定发酵液中酒精、总酸、氨基酸态氮、多糖和黄酮等的含量。
不同的黄酮处理方式对苦荞醋中最终黄酮含量的影响：将提取出来的黄酮加入经提取多糖黄酮后的苦荞粉酿制的醋液中。
1.3.4 测定方法
还原糖含量测定：参考GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》[12]；乙醇含量的测定：参考GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》[13]；发酵液中黄酮含量的测定：按照参考文献[14]的方法测定；发酵液中多糖含量的测定：按照参考文献[15]的方法测定；酸含量的测定：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》[16]；氨基酸态氮含量的测定：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》[17]。
2 结果与分析
2.1 粉碎度对糖化效果的影响
图1 粉碎度对苦荞粉糖化效果的影响
Fig.1 Effect of fragmentation degree on tartary buckwheat powder saccharification
由图1可知，未过筛（＜20目）的苦荞粉糖化醪糖化效果最差（还原糖含量11.07 g/100 g），粉碎度为40～60目的苦荞粉糖化醪糖化效果最好（还原糖含量12.82 g/100 g），略高于粉碎度60～80目、20～40目、≥80目的苦荞粉糖化醪中的还原糖含量，后两者可能因为苦荞粉太细，苦荞多糖充分溶出后阻碍了还原糖的进一步溶解。
2.2 糊化对发酵的影响
2.2.1 糊化对还原糖含量的影响
根据苦荞醋的工艺流程，分别取160 g原粉和已提黄酮多糖的苦荞粉进行糊化、液化、糖化处理，另分别取160 g不做糊化处理，直接液化、糖化，分别测四种试验的还原糖含量，结果见图2。
由图2可知，糊化能够提高还原糖的含量。糊化使得提取黄酮和多糖的苦荞粉与原粉中的还原糖含量分别提高了32.57%、7.33%，且糊化后提取多糖黄酮的发酵液还原糖含量稍高于原粉。
图2 糊化对还原糖含量的影响
Fig.2 Effect of gelatinization on reducing sugar content
2.2.2 糊化对酒精含量的影响
由图3可知，未经糊化处理提取黄酮多糖的苦荞粉酒精发酵液酒精含量（9.85%vol）比糊化的酒精含量（8.3%vol）提高了19%，原粉糊化处理的酒精发酵液酒精含量比未糊化的酒精含量提高了11%。在酒精发酵阶段，提取黄酮多糖经糊化处理的发酵液黏稠度比未糊化处理的发酵液黏稠度高，导致还原糖利用不完全，因而发酵液中还原糖含量高但酒精含量低。
图3 糊化对酒精含量的影响
Fig.3 Effect of gelatinization on alcohol content
2.2.3 糊化对酒精发酵上清液体积的影响
糊化后静置30 min，糊化对酒精发酵醪上清液体积的影响结果见图4。
图4 糊化对酒精发酵液上清液体积的影响
Fig.4 Effect of gelatinization on the volume of supernatant of alcohol fermentation broth
由图4可知，原粉糊化后的酒精发酵液上清液体积（80mL）不到未糊化体积（260 mL）的1/3。未经过糊化处理的提取黄酮多糖的苦荞粉酒精发酵液上清液体积（340 mL）高于原粉糊化后发酵所得上清液体积（300 mL），这是由于多糖的提取使得发酵液黏度降低，液体和固体更易分离。
综上所述，蒸煮糊化对苦荞醋的发酵的优势并不明显，提取黄酮和多糖的苦荞粉采用不糊化的发酵工艺效益更高。所以苦荞醋的酿造工艺选择不糊化处理。
2.3 添加蛋白酶对发酵的影响[18]
2.3.1 添加蛋白酶对酒精含量的影响
图5 添加蛋白酶对酒精含量的影响
Fig.5 Effect of protease addition on alcohol content
酸前为糖化前加酸性蛋白酶；中前为糖化前加中性蛋白酶；碱前为糖化后加碱性蛋白酶；酸后为糖化后加酸性蛋白酶；中后为糖化后加中性蛋白酶；碱后为糖化后加碱性蛋白酶。下同。
由图5可知，在提取黄酮、多糖的苦荞粉和原粉的液态法酿醋过程中，糖化前后添加酸性、中性、碱性蛋白酶对发酵醪酒精含量的影响较大，对原粉均有明显的提高，其中糖化后加入酸性蛋白酶的酒精含量最高（9.15%vol），比空白样（5.55%vol）增加65%；对提取黄酮、多糖的苦荞粉，蛋白酶的添加不如对原粉的影响大，但糖化后加入中性蛋白酶的酒精含量最高（9.48%vol），稍微高于空白（9.05%vol）。从酒精含量来看，提取黄酮多糖的苦荞粉产酒精量优于原粉，蛋白酶的添加有助于酒精发酵，这可能是因为多糖和黄酮提取后，去掉了水溶性和醇溶性物质，剩下淀粉等糖类物质的占比增加，黏度降低，提高酶及微生物的作用效率，导致酒精含量增加。
2.3.2 添加蛋白酶对总酸的影响
从醋酸发酵开始，每天取样测酸度，直到酸度略有下降，停止取样，结束发酵。
由图6可知，不同处理的原粉总酸含量在发酵第1、2天无明显差异，第3天后总酸含量开始产生差距，在第6天时达到最高总酸含量；由图7可知，提取黄酮多糖的苦荞粉醋酸发酵的第1天总酸含量开始上升，糖化后添加中性蛋白酶的酒精含量从第3天开始高于其他处理，第6天时达到最大值（5.2 g/100 mL）。
图6 蛋白酶对未提取黄酮和多糖的苦荞醋酸发酵时总酸的影响
Fig.6 Effect of protease on total acid in the acetic fermentation process of tartary buckwheat without extracting flavonoids and polysaccharides
由图7可知，相比于蛋白酶对酒精发酵阶段的影响，蛋白酶的添加对总酸含量影响不大，可能是因为蛋白酶对酵母菌的影响比醋酸菌明显。提取黄酮多糖的苦荞粉与原粉在发酵结束时，均是糖化后添加中性蛋白酶的处理总酸含量最高（5.23 g/100 mL、5.2 g/100 mL），但含量无显著差异。
图7 蛋白酶对提取黄酮和多糖后的苦荞醋酸发酵时总酸的影响
Fig.7 Effect of protease on total acid in the acetic fermentation process of tartary buckwheat after extracting flavonoids and polysaccharides
2.3.3 添加蛋白酶对氨基酸态氮的影响
分别取酒精发酵结束后、刚添加醋酸菌种子液时（醋酸发酵第0天）和醋酸发酵结束后的上清液，测定氨基酸态氮含量。结果见图8和图9。
由图8和图9可知，醋酸发酵初始样氨基酸态氮含量均下降，是因为酒精发酵完后加水将酒精度调到6%vol，使得氨基酸态氮含量被稀释；醋酸发酵后又小幅度降低，可能是因为醋酸菌生长过程消耗。与空白样相比，蛋白酶的添加可以增加苦荞醋中氨基酸态氮的含量。提取黄酮多糖的苦荞粉糖化后添加酸性蛋白酶效果最好，其含量（0.12g/100mL）比空白（0.07 g/100 mL）提高了71.43%。
图8 未提取黄酮和多糖苦荞在发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
Fig.8 Changes in amino acid nitrogen content in the fermentation process of tartary buckwheat without extracting flavonoids and polysaccharides
图9 提取黄酮和多糖后苦荞在发酵过程中氨基酸态氮含量的变化
Fig.9 Changes of amino acid nitrogen content in the fermentation process of tartary buckwheat after extracting flavonoids and polysaccharides
2.3.4 添加蛋白酶对多糖的影响
图10 添加蛋白酶对多糖含量的影响
Fig.10 Effect of protease addition on polysaccharides contents
由图10可知，原粉发酵液多糖含量均高于提取黄酮多糖的苦荞粉发酵液的含量，因为原粉预处理时未提取多糖，两者醋酸发酵液多糖含量均高于酒精发酵液。原粉酒精发酵液多糖含量参差不齐，酒精发酵结束后的最高多糖含量（6.95mg/mL）为糖化前添加碱性蛋白酶，是空白（2.49mg/mL）的两倍多，而醋酸发酵结束后的最高和最低多糖含量分别为糖化后添加酸性蛋白酶（8.72 mg/mL）和未添加蛋白酶（2.51 mg/mL）；提取多糖黄酮的苦荞粉醋酸发酵液多糖含量均高于空白（2.06 mg/mL），糖化后添加碱性蛋白酶的醋酸发酵液多糖含量最高（3.44 mg/mL），可知蛋白酶的添加有助于多糖的溶出或生成。
2.3.5 添加蛋白酶对黄酮的影响
由图11可知，原粉的醋酸发酵液相比于酒精发酵液，除在糖化后添加中性蛋白酶的处理黄酮含量上升了0.04mg/mL外，其余处理均降低，糖化后添加中性蛋白酶的处理黄酮含量最高（4 mg/mL），其余五种发酵液相差不大。提取多糖黄酮的苦荞粉醋酸发酵液相比于酒精发酵液，除糖化后添加中性蛋白酶的黄酮含量小幅度降低外，其余处理黄酮含量明显降低。
图11 添加蛋白酶对黄酮含量的影响
Fig.11 Effect of protease addition on flavonoids contents
综合以上蛋白酶的添加对酒精含量和总酸含量的影响可知，未提取黄酮多糖的苦荞粉在发酵过程中酒精含量均高于未添加蛋白酶的处理，总酸含量几乎相等。从实验结果来看，添加蛋白酶的处理样中氨基酸态氮、多糖、黄酮均高于空白样，以酒精发酵和醋酸发酵为主，结合各项指标，糖化后加入中性蛋白酶的处理总体优于其他六种蛋白酶添加方式，所以选择糖化后加入中性蛋白酶进行后续苦荞醋发酵。
2.4 不同的黄酮处理方式对苦荞醋中最终黄酮含量的影响
在以苦荞为原料酿制苦荞醋的过程中，黄酮损失较大，降低了苦荞醋的保健功能，本试验在以提取多糖黄酮的苦荞粉酿制的苦荞醋中加入预处理时提取出的黄酮，并在同样条件下以未提取多糖黄酮的苦荞粉酿造苦荞醋，对比两种黄酮处理方式对苦荞醋中最终黄酮含量的影响。将提取出来的黄酮按20.78 mg/g加入160 g苦荞粉酿制的醋中，结果如图12。
由图12可知，醋酸发酵结束后提取黄酮多糖的苦荞粉酿制的苦荞醋黄酮含量（1.35 mg/mL）低于原粉（3.02 mg/mL），将预处理时提取出的黄酮加入到提取黄酮多糖的苦荞粉所酿的醋中，其黄酮含量（5.20 mg/mL）比原粉所酿的醋增加72%，高于张素云[19]所酿苦荞醋黄酮含量（3.53 mg/g），更是远高于申瑞玲[20]研究的苦荞醋（0.496 mg/mL），可知将黄酮提取后加入酿制好的醋中，黄酮的损失较小，可以得到比原粉酿醋黄酮高得多的苦荞醋。
图12 不同处理方式对苦荞醋黄酮含量的影响
Fig.12 Effect of different treatment methods on flavonoids content in Tartary buckwheat vinegar
3 结论
提高苦荞醋黄酮含量的工艺研究表明，蒸煮糊化对苦荞醋的发酵的优势并不明显，提取黄酮和多糖的苦荞粉酒精发酵液上清液体积比原粉酒精发酵液上清液体积明显增加，蛋白酶的添加有助于氨基酸态氮生成、多糖溶出和酒精发酵，糖化后添加中性蛋白酶的酒精发酵液酒精度为9.48%vol，黄酮的损失最小，通过将黄酮提取后再加入苦荞醋的方式有效的减少黄酮在发酵过程中的损失，得到的高黄酮苦荞醋的最佳工艺为破碎度＞40目，糖化后添加中性蛋白酶，不糊化，在提取黄酮、多糖后的苦荞粉酿制的醋中再加入黄酮（黄酮添加量：苦荞中提取出的黄酮20.78 mg/g），得到的苦荞醋中黄酮含量为5.20 mg/mL，高于传统苦荞醋黄酮含量，说明将黄酮提取后再加入苦荞醋的方式能有效减少黄酮在发酵过程中的损失，从而更进一步增加苦荞醋的养生功效。
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