香菇（Lentinus edodes）是我国特产食用菌，也是食用菌中最具有代表性的品种之一，不仅肉质肥厚脆嫩，滋味鲜美，香气独特，而且具有很高的营养、药用和保健价值[1]，深受人们的喜爱。据中国食用菌协会统计，2017年我国香菇产量986.51万t，占全国食用菌总产量的26%以上，是产量最大的食用菌品种。近年来，随着人们生活水平的不断提高，香菇国际国内市场日益扩大，香菇加工开始向多元化方向发展，对香菇产品的开发已有很多研究报道[2-7]，如香菇面包、香菇饼干、香菇保健茶、香菇酥糖、香菇热狗肠、香菇酱等。由于香菇含有丰富的呈味物质，独特的鲜美滋味使其深加工成为调味料开发的重要方向。目前在调味料上还是以粗加工为主，工艺简单，香菇的鲜味和滋味物质释放不完全，特征香气不明显，因此有必要研究开发一种香菇深加工风味产品。
热反应技术是改进食品风味和制取新型风味物质的重要手段，广泛应用于香精领域，利用各种不同糖类和氨基酸化合物的热反应能产生各种不同的风味物质[8-9]，热反应的程度和系统中的组分、温度、时间以及pH值等条件有关[10]。各种深入研究发现采用合适的天然原料，如水解动物蛋白、水解植物蛋白等代替氨基酸来制备香精，可以使得产品的风味更佳饱满逼真[11]。目前，国内外对香菇的研究主要集中在栽培技术、干制加工、功能成分提取及活性研究等，对干香菇的挥发性香味成分分析研究的也较多，而对其热反应香精的风味研究鲜见报道，香菇中氨基酸丰富，含有构成蛋白质的20种氨基酸中的18种，且含有丰富的糖类，这些都是制备热反应香精的风味前提物质。因此，本研究选用香菇酶解液为原料，添加外源氨基酸和还原糖进行热反应，制备一款具有菌菇风味、能增香增鲜的新型食品调味料，以期为香菇的精深加工提供一条新途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菇：购自西峡县孙氏菌业专业合作社，烘干后粉碎过80目筛，取筛下物密封保存备用；中性蛋白酶（酶活0.8AU/g）：诺维信投资有限公司；氢氧化钠、木糖、L-半胱氨酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；浓盐酸（分析纯）：烟台市双双化工有限公司。
1.2 仪器与设备
ZX-9140MBE数显鼓风干燥箱、SHZ-B水浴恒温振荡器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；XB-20B多功能粉碎机：上海兆申科技有限公司；FA2004C分析天平：上海越平科学仪器有限公司；超声波细胞破碎仪：上海汗诺轩仪器有限公司；HC-3018高速冷冻离心机：安徽中科中加科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：河南省予华仪器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：济南海能仪器股份有限公司；MJ-78A高压灭菌锅：施都凯仪器设备上海有限公司；Advanced-Ⅰ艾柯超纯水机：台湾艾柯成都康宁实验专用纯水设备厂；Agilent 7890A-5975C气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪：美国Agilent公司；固相微萃取手柄、50 μmDVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 香菇酶解液的制备
取适量香菇粉，按照料液比1∶15（g∶mL）加去离子水混合均匀，超声细胞破碎仪作用10 min（超声功率800W、频率20 kHz），添加0.7%中性蛋白酶在50 ℃酶解3 h后，沸水浴灭酶10 min，冷却，4 000 r/min离心20 min，取上清液即为酶解液（其水解度为18.36%）。
1.3.2 热反应制备菇精的试验
（1）热反应原料的确定
称取香菇酶解液40 g，分别加入不同含量木糖（0.2 g、0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g）、不同含量半胱氨酸（0.05 g、0.10 g、0.15 g、0.20 g、0.25 g），在100 ℃反应2 h，考察热反应原料对热反应的影响，通过感官评分和热反应中间产物A280nm值来确定热反应原料的添加量。
（2）热反应条件优化单因素试验
称取香菇酶解液40 g，添加木糖0.6 g和半胱氨酸0.1 g，考察不同反应温度（80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃），不同反应时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h），不同反应pH值（5、6、7、8、9）对热反应的影响，通过感官评分和热反应中间产物A280nm值来确定热反应条件。
（3）热反应条件优化正交试验
表1 热反应条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization
在单因素试验的基础上，以感官评分为评价指标，选择反应温度、反应时间、反应pH值3个因素进行正交试验，对热反应条件参数进行优化。正交试验因素与水平设计见表1。
1.3.3 分析检测
（1）热反应中间产物的检测[12]
热反应产物中的低分子质量香味中间体可以用280 nm波长处紫外吸光度值表示，吸光度值越大，香味物质越多。将热反应产物稀释100倍，以蒸馏水作为参比溶液，在280 nm波长处测定吸光度值。
（2）热反应产物的感官评价[13]
由五位有感官评定经验的评定人员从焦香味、糊味、香菇特征香气、整体香气4个方面对热反应产物进行感官评定。焦香味、糊味、香菇特征香气和整体香气所占的权重分别是20%、20%、30%和30%，感官评分取加权平均数，总分9分。热反应产物感官评分标准见表2。
表2 热反应产物感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of thermal reaction products
（3）气质联用分析[14]
固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）条件：取10 mL样液放入40 mL萃取瓶中，盖上瓶盖在60 ℃水浴搅拌中平衡20 min后，用萃取头吸附30 min，然后将萃取头插入气质联用仪的进样器中解吸5 min。
气相色谱条件：采用HP-5MS毛细色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm），载气氦气（He），流速1 mL/min，不分流，进样口温度230 ℃；程序升温起始温度35 ℃，保持5 min，5 ℃/min升温至150 ℃，再以10 ℃/min的速率升至220 ℃，保持2 min，检测器温度：280 ℃。质谱条件：电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，四极杆温度150 ℃，质谱接口温度250 ℃，质量扫描范围30～550 m/z。
2 结果与分析
2.1 热反应原料的确定
2.1.1 木糖添加量的确定
还原糖是热反应中重要的反应物质，木糖价廉易得，反应活性好，是呋喃类物质产生的良好前体物，还能促进焦香味和甜味产物产生[15-16]。由图1可知，在40 g香菇酶解液中，随着木糖添加量的增加热反应中间产物A280nm值逐渐增加并趋于平缓，说明木糖增加使热反应程度增大并产生更多的风味物质。热反应产物的感官评分随木糖添加量的增加不断升高，但木糖添加量为0.7 g时感官评分反而低于0.6 g时，这可能是由于木糖添加量过多，发生过度焦糖化反应，导致产物产生焦糊味使感官评分降低。综合考虑木糖的最适添加量为0.6 g。
图1 木糖添加量对热反应的影响
Fig.1 Effect of xylose addition on thermal reaction
2.1.2 半胱氨酸添加量的确定
图2 半胱氨酸添加量对热反应的影响
Fig.2 Effect of cysteine addition on thermal reaction
香菇中蛋白质含量很高，且氨基酸种类丰富[17]，酶解后是一种理想的热反应原料。不同的氨基酸在热反应中会产生不同的风味，在香菇酶解液中添加一定量的半胱氨酸，有助于形成更多的香味物质[18]。由图2可知，在40 g香菇酶解液中，随着半胱氨酸添加量的不断增加，热反应中间产物A280nm值和热反应产物的感官评分均呈先上升后下降的趋势，二者变化趋势相似，半胱氨酸添加量为0.1 g时A280nm值和感官评分最高。半胱氨酸添加量太多会造成热反应产物产生硫味，使感官评分降低。因此，半胱氨酸添加量选择0.1 g。
2.2 热反应条件的单因素试验
2.2.1 反应温度对热反应的影响
在初始pH值为6的条件下反应2 h，温度对热反应的影响见图3。由图3可知，反应温度较低时，热反应较为缓慢，此时，热反应中间产物A280nm值和热反应产物的感官评分都处于较低水平；随着温度的升高，反应底物活性增加，热反应进程不断加速，温度每升高10 ℃，反应速率增加3～5倍，热反应产物增加，因此，热反应中间产物A280nm值升高趋势加快，热反应产物的感官评分逐渐增加；但反应温度过高热反应产物会产生焦味和异味，致使热反应产物的感官评分下降明显。因此，最适的反应温度为100 ℃，这与张书香等[19]研究结果相一致。
图3 反应温度对热反应的影响
Fig.3 Effect of reaction temperature on thermal reaction
2.2.2 反应时间对热反应的影响
图4 反应时间对热反应的影响
Fig.4 Effect of reaction time on thermal reaction
在反应温度100 ℃、初始pH值为6的条件下，反应时间对热反应的影响见图4。由图4可知，反应时间较短时，热反应发生不完全，产物生成较少，随着反应时间的延长，热反应发生充分，产物含量增加，因此，热反应中间产物A280nm值和热反应产物的感官评分逐渐增加；但时间延长到2 h后，会出现焦糊味影响热反应液的可接受性，从而引起感官评分降低。因此，反应时间选择2 h为宜。
2.2.3 反应pH值对热反应的影响
在反应温度100 ℃、时间2 h的条件下，采用不同反应pH值进行热反应，结果见图5。由图5可知，不同的起始反应pH值对热反应产物的风味存在影响[20]。随着pH值的升高，热反应中间产物A280nm值不断增加，这符合热反应在pH 3～10时随着pH升高而加剧的一般规律。热反应产物的感官评分随着pH值的升高先升后降，当pH值达到6.0以上时，由于氨基的反应性加强，热反应速度加快，导致产生不良风味[21]（如NH3等）。因此，选择最适反应pH值为6。
图5 反应pH值对热反应的影响
Fig.5 Effect of reaction pH value on thermal reaction
2.3 热反应条件的优化
根据单因素试验结果，以感官评分为考察指标，对热反应温度、时间、pH值进行3因素3水平正交试验，结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 热反应条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for thermal reaction conditions optimization
由表3可知，经极差分析可知，3个因素对感官评分的影响从大到小的顺序为A＞C＞B，即反应温度影响最大，其次是反应pH值和反应时间。最优水平组合为A2B1C3，即反应温度为100 ℃，反应时间为1.5 h，反应pH值为7。在此优化条件下进行3次平行验证试验，其反应产物感官评分为8.8。由表4方差分析可知，反应温度对感官评分影响显著（P＜0.05），而反应时间和反应pH值对感官评分无显著影响（P＞0.05）。
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“*”表示在0.05水平对结果影响显著。
2.4 香菇酶解液热反应后挥发性风味物质分析
将所得最优组合条件下的热反应产物经GC-MS分析，热反应产物的挥发性成分总离子流色谱图见图6，分离鉴定出的挥发性风味物质组成及相对含量见表5。
图6 热反应产物的挥发性成分总离子流色谱图
Fig.6 Total ionization chromatogram of volatile flavor substances in thermal reaction products
由表5可知，香菇酶解液经过热反应后共检测出20种挥发性风味物质，主要包括含硫化合物3种（72.28%），含氮化合物1种（11.86%），醛类7种（11.51%），醇类4种（2.80%），酯类4种（1.20%），烃类1种（0.35%）。很多研究表明[22-25]，含硫化合物是香菇风味的重要物质，其阈值较低，能影响香菇的整体风味，本实验热反应产物中检测出1,2,4-三硫杂环戊烷、1,2,4,5-四硫杂环己烷、1,2,4,5,7-五硫杂环辛烷，这些含硫化合物总相对含量占绝对优势，因此对热反应产物风味的贡献最大。但香菇中常见的1,2,3,5,6-五硫杂环庚烷并未检测出，这可能与其受热不稳定易分解有关。八碳化合物也被认为是香菇的重要风味物质，1-辛烯-3-醇、3-辛醇、2-辛烯-1-醇均在本实验热反应产物中检测到，这些化合物具有典型的蘑菇香味，是蘑菇特征香味的重要组成部分。据报道[26]，热反应能够引起脂肪酸的降解生成阈值较低的醛类挥发性化合物，热反应产物中检测出相对含量较高的醛类化合物，与这一研究报道相符合。此外，热反应产物中还检测到含氮化合物、酯类、烃类等，这些化合物对产物的整体香气有协调和互补的作用。所有这些挥发性风味物质共同构成热反应产物香菇菇精的特殊风味。
表5 热反应产物中挥发性风味物质GC-MS分析结果
Table 5 Analysis results of volatile flavor substances in thermal reaction products by GC-MS
3 结论
本试验利用热反应制备香菇菇精，通过单因素和正交试验对热反应工艺条件进行了优化，确定了菇精的热反应最佳工艺为香菇酶解液40 g，木糖0.6 g，半胱氨酸0.1 g，反应温度100 ℃，反应时间1.5 h，pH值为7。在此优化条件下，所得的菇精香菇味浓厚、焦香味突出、无糊味且整体香气协调。采用固相微萃取-气质联用技术对所制备的香菇菇精中挥发性风味物质进行分析，共检测出20种挥发性风味物质，包括含硫化合物（72.28%），醛类7种（11.51%），醇类（2.80%），酯类（1.20%）等，其中含硫化合物总相对含量占绝对优势，对香菇精风味贡献最大；具有蘑菇特征香味的八碳化合物类在热反应产物中均存在。所有这些挥发性风味物质共同构成热反应香菇菇精的特殊风味。
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