东北酸菜是以白菜为发酵原料腌制而成，作为中国传统的发酵蔬菜食品，是餐桌上的常见美食。它的滋味咸酸鲜美、口感脆嫩诱人，有去腻开胃、醒酒提神的功效。不仅能够提高食欲、有助消化，还可以帮助人体对铁元素的吸收[1]。东北酸菜加工产业发展迅速[2]，然而现有的蔬菜加工企业普遍采用传统的自然发酵[3]或依赖于单一的乳酸菌发酵蔬菜，导致酸菜产品口感较差、风味不足。国内外的学者对酸菜中的优势菌群的研究往往也仅聚焦于乳酸菌和它在酸菜发酵过程中的影响[4-6]。然而研究表明，酵母菌对酸菜发酵过程中风味物质的产生和发酵完成后成品的贮藏有着十分关键的作用[7-8]。在酸菜发酵过程中适时适量的添加酵母菌不仅可通过酵母本身的酒精发酵产出乙醇[9]，又可以通过进一步与有机酸相互反应产生酯类的芳香物质[10-11]，丰富酸菜的口感，提高产品品质。同时，酵母菌对蔬菜原料中的可发酵糖利用十分完全，能够防止剩余可发酵糖被腐败菌利用而致使产品腐败变质，有利于延长产品的贮藏期[12]。在东北酸菜发酵过程中添加酵母菌辅助发酵过程提高酸菜品质具有巨大的开发前景和应用意义。直投式发酵剂是标准化和浓缩的发酵剂菌种，可径直放入蔬菜原料中进行发酵，明显缩短发酵周期，大大加强发酵产品的品质与安全性，使生产过程更为可控[13-14]。开展东北酸菜发酵酵母菌直投式发酵剂的研究，对东北酸菜生产的产业化应用有重大价值。
湿物料被降温至其的共晶点或者玻璃化转变温度之下，其中大多数水冷冻凝结为冰，剩余的水分与物料因素变为非晶态（玻璃态）的过程称为真空冷冻干燥[15]。细胞在这个过程中会受到多种伤害，如机械损伤、细胞膜通透性改变、蛋白质变性、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）损伤等[16]。冻干保护剂的添加能够提高细胞稳定性、减少细胞在冻干过程中的受损程度[17]，使酵母菌在冷冻干燥进程中保持原有理化特性和生物活性[18]。冻干保护剂还可充当支持物与受体为干物质在细胞复水的进程中供给框架结构[19]。目前，普遍使用、效果良好的真空冷冻干燥保护剂有海藻糖、白蛋白、明胶、山梨醇、蔗糖、乳糖、精氨酸、脱脂乳、赖氨酸、甘油、碘化钾和聚乙二醇等聚合物等[20-21]，这些保护剂玻璃化转化温度高，它们利用降低游离水含量来减缓晶核生成过程，下降相变温度，增强细胞膜流动性，从而避免冻干导致细胞蛋白质变性，缩小菌体细胞在冻干过程中被暴露在氧气与介质中的面积，在菌体表面生成保护膜，提高菌体的存活率[22]。
本试验以实验室前期从发酵酸菜中分离得到并验证对风味有增香作用的异常汉逊酵母（Hansenula anomala）作为东北酸菜的发酵辅助菌种，结合使用Plackett-Burman试验设计与最陡爬坡法，筛选出具有显著作用的保护剂成分，利用响应面分析法优化保护剂配方，最大限度提高菌体存活率，以期为东北酸菜发酵酵母菌直投式发酵剂的研究与应用提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
异常汉逊酵母（Hansenula anomala）：本实验室前期分离鉴定并保藏；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：北京索莱宝生物科技有限公司；脱脂乳粉：完达山乳业有限公司；海藻糖、抗坏血酸钠、碳酸氢钠、硫酸锰、谷氨酸钠、木寡糖、甘油等（分析纯）：购于天津市福晨化学试剂厂和阿拉丁试剂（上海）有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2G无菌操作台：上海鼎科科学仪器有限公司；OHG-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；XM-30R立式压力蒸汽灭菌器、HZQ-Q型电热恒温培养箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；Neofuge 23R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；LGJ-12真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
异常汉逊酵母菌种活化→菌种扩大培养→离心收集菌体→加入冻干保护剂→分装→预冻→真空冷冻干燥→酵母菌冻干粉
菌种活化及培养：将异常汉逊酵母置于YPD培养基中活化，30 ℃条件下180 r/min摇床培养24 h。
离心收集菌体、分装：用振荡器把离心（5 000 r/min、10 min）后收集到的异常汉逊酵母菌泥与1/10原发酵液体积的冻干保护剂溶液混合振荡，使其均匀，制为菌悬液。
预冻：将菌悬液倒入无菌的培养皿中，冻干的厚度大约为0.5 cm为宜。
真空冷冻干燥：冷冻干燥前先于-20 ℃预先冷冻12 h，然后于真空度10～20 Pa 条件下冷冻干燥24 h左右，让冷冻干燥后菌粉的水分含量大约3%。
1.3.2 试验设计
试验响应目标为冻干后异常汉逊酵母存活率：在经过Plackett-Burman设计法对异常汉逊酵母存活率有影响的每个因素中筛选得到具有明显作用的因素后，采用最陡爬坡法探究最大响应区域。然后利用响应面法中的Box-Behnken优化设计继续实验研究，通过所得到的数据获得二阶响应面模型，从而最终确定异常汉逊酵母最优冻干保护剂的配比。
1.3.3 测定方法
活菌计数方法：用0.9%的无菌生理盐水致冻干粉复水达原体积。菌种计数方法：梯度稀释平板法。
酵母存活率计算公式如下：
1.3.4 数据分析
用Design-Expert 8.0软件（StatEase Inc.，Minmeapolis，USA）和Minitab软件进行试验设计与数据分析。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman 试验设计筛选显著影响因素
通过Plackett-Burman（PB）试验设计筛选脱脂乳、海藻糖、抗坏血酸钠、碳酸氢钠、硫酸锰、谷氨酸钠、木寡糖、甘油这8个因素[23]中对异常汉逊酵母存活率有明显影响的因素，每个因素分别取2个水平，PB试验因素与水平见表1，结果见表2，各因素效应分析见表3。
表1 Plackett-Burman设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design
由表3可知，此模型在0.05水平上足以拟合试验数据，对异常汉逊酵母存活率有明显影响的因素为木寡糖、脱脂乳与海藻糖，剩余因素作用效果不显著。故继续探究此3个因素。脱脂乳、木寡糖、海藻糖的估计系数都是正值，对异常汉逊酵母存活率的影响都有显著性正效应。
表2 Plackett-Burman试验设计及结果
Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments
表3 Plackett-Burman试验设计各因素效应分析
Table 3 Effect analysis of Plackett-Burman experiments design
2.2 最陡爬坡试验
依据脱脂乳、木寡糖、海藻糖这3个因素效应大小比例和其的方向决定最陡爬坡法的变化方向和步长，它们的效应都呈现正效应，所以变化方向为正向变化。试验设计结果见表4。
表4 最陡爬坡试验设计及结果
Table 4 Designs and results of the steepest experiments
由表4可知，第5组试验中异常汉逊酵母菌体的存活率最高，为81.12%。因此响应面优化研究试验中心点选择为第5组试验中3因子水平。
2.3 响应面分析
2.3.1 Box-Benhnken 设计及响应面结果分析
以异常汉逊酵母菌体的存活率（Y）为响应值，PB试验筛选出的木寡糖（A）、脱脂乳（B）、海藻糖（C）3个显著因素为试验因素，依据最陡爬坡法的结果设计Box-Behnken 分析方案。确定了3因素3水平，17个试验点（5个中心点）的组合试验。试验因素与水平见表5，响应面试验优化设计与结果见表6，响应面试验方差分析见表7。
表5 异常汉逊酵母菌存活条件优化响应面试验因素与水平
Table 5 Factors and levels of Box-Benhnken experiments for survival conditions optimization of Hansenula anomala
利用Design-Expert 8.0软件将表6中数据二次多元回归拟合分析，获得异常汉逊酵母菌体存活率对脱脂乳、海藻糖和木寡糖的二元多项式回归方程为Y=+80.97+3.77A+3.14B+1.52C-2.07AB-3.33AC-3.19BC-3.93A2-4.25B2-3.80C2。
表6 异常汉逊酵母菌存活条件优化Box-Benhnken设计方案及结果
Table 6 Design and results of Box-Benhnken experiments for survival conditions optimization of Hansenula anomala
表7 响应面试验回归方程方差分析
Table 7 Analysis of variance of regression equation
由表7可知，模型F值105.577 6，P＜0.000 1说明此模型显著。失拟向F值2.900 678，P=0.165 1＞0.05失拟向不显著，说明此方程能够体现实际问题。决定系数R2=0.992 7，说明此模型相关性良好。调整决定系数R2Adj=0.983 3，表明该模型能够说明98.33%的响应面值的变化。变异系数（coefficient of variation，CV）为1%，信噪比为29.719，故可以用该模型对试验结果预测。方差分析的结果显示，脱脂乳、海藻糖、木寡糖这3 个因素对于异常汉逊酵母菌体存活率影响作用均极其明显，此3个因素对异常汉逊酵母菌体存活率的影响作用大小顺次为木寡糖＞脱脂乳＞海藻糖。
通过软件Design-Expert 8.0 绘制3个因素对异常汉逊酵母菌体存活率影响的等高线和响应面分析图，结果见图1。由图1可知，这3个响应面在所定范围之中均具有极值点，展现为开口向下的凸形球面。响应面曲面图直观反映各因素间的交互作用对响应值影响的显著程度，曲面图越陡表示交互作用越强，曲面图越平则表示交互作用越弱。
图1 脱脂乳、木寡糖和海藻糖添加量交互作用对菌体存活率影响的等高线及响应曲面
Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interactions between each factors on skim milk,xylooligosaccharide and trehalose on cell survival rate
依据此试验优化设计研究后得到的异常汉逊酵母最优冻干保护剂为脱脂乳21.8 g/100 mL，海藻糖11.6 g/100 mL，木寡糖0.6 g/100 mL，在此条件下预测到的菌体存活率为82.20%。
2.3.2 验证试验
将试验结果进行3组重复验证性试验，得到平均菌体存活率实际值为82.11%，与试验预测值基本吻合，表明此数学模型精确可信。
3 结论
通过Plackett-Burman 试验设计，从8种保护剂中筛得对异常汉逊酵母（Hansenula anomala）的存活率有显著作用的脱脂乳、木寡糖、海藻糖3种保护剂，这三种保护剂对异常汉逊酵母保护性能十分优良。脱脂乳主要作用是在冻干过程中避免菌体表面受伤，让溶液呈现过冷态，进而减缓溶液结冰，在一定温度下能减少细胞因脱水、盐类浓缩带来的伤害。木寡糖这种功能性聚合糖有优良的稳定性和保水性，能够减少结晶。海藻糖可以在生物大分子失水的情况下用氢键相连失水点，产生保护膜替代所失的结构水膜，还可以增进玻璃体的生成，减弱冰晶生成避免其破坏蛋白质和细胞。
根据PB筛选试验结果设计最陡爬坡试验的方向和步长，确立了响应面优化试验的中心点。在Box-Behnken优化设计方案和数据分析下创立二次多元数学模型，同时用统计学方法对模型进行显著性检验。进一步进行方差分析、响应面分析和等高线分析，研究各因素之间的交互作用。分析得出，脱脂乳、海藻糖和木寡糖这3个因素对异常汉逊酵母菌体存活率的影响均极其明显，脱脂乳和木寡糖的交互作用、脱脂乳和海藻糖的交互作用及海藻糖和木寡糖的交互作用都极其明显。各因素对异常汉逊酵母菌体存活率的影响作用大小为木寡糖＞脱脂乳＞海藻糖。最终得出最优保护剂配比：脱脂乳21.8 g/100 mL，海藻糖11.6 g/100 mL，木寡糖0.6 g/100 mL，菌体存活率预测值为82.20%，验证试验实际值为82.11%。表明此模型可信，为异常汉逊酵母的开发应用提供了数据支持，对酵母菌参与发酵东北酸菜改良酸菜品质有推动意义。
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