火棘果（Pyracantha fortuneana）又名火把果等，苹果亚科火棘属，据报道含有7种人体必需氨基酸和2种婴幼儿必需氨基酸[1-2]，此外，还含有丰富的黄酮类物质、多酚、槲皮素等，具有提高免疫力、清除自由基、抗疲劳、抗肿瘤等功效[3-4]，主要分布于我国东南、西南和西北部地区，其中贵州省在黔南独山县、铜仁、毕节地区有大量分布[5]。枸杞（Lycium chinensis）又名枸杞子等，茄科枸杞属，富含枸杞多糖、维生素C（vitamin C，VC）、亚油酸等多种活性成分[6-7]，是我国传统的药食同源佳品。药用种类主要为宁夏枸杞[8]，具有良好的生理功效，可增强人体免疫能力，缓解腰肌酸痛和头昏耳鸣等，主要分布于我国西北地区[9]。杜琨[10]利用单一酵母菌株发酵研究了金樱子与火棘果复合制作保健果酒，产品具有独特的金樱子火棘果香；蒋春兰等[11]的研究表明，火棘果酒的抗氧化作用非常强，对2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐（2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基的清除作用明显；聂中良等[12]研究了昆明地区野生火棘果酿酒工艺，其最佳发酵条件为初始糖度16%，初始pH值为7.0，发酵温度27 ℃，酵母添加量0.7%，酒体呈亮红色，具有火棘果果酒的独特风格；李秀秀等[13]研究了枸杞与石榴发酵酿酒工艺，其最佳发酵条件为石榴枸杞果汁体积比2∶1，酵母接种量3%，发酵时间6 d，发酵温度28 ℃，酒体香纯厚，透明度高；王玉良等[14]研究了黄精枸杞酒的成分，结果显示黄精枸杞酒中富含大量的总皂苷、多糖和微量的黄酮类化合物。目前主要使用单一菌株和单一原料进行发酵酿造，利用枸杞复合其他原料酿酒已有报道，其酿酒工艺研究也越来越深入。
本试验以产自贵州毕节地区的野生火棘鲜果和宁夏枸杞干果为原料，利用本实验室保藏的两株性能良好的酵母菌株，采用响应面法优化发酵工艺条件，研发了一款具有良好保健功效的果酒产品，旨在探索贵州地区野生火棘果资源的深加工技术，以期带动当地经济产业结构升级，助力国家精准扶贫工程。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生火棘果：采自贵州毕节地区，选用饱满完整无缺的新鲜火棘果，置于低温冰箱中备用；枸杞干果：选购自宁夏产区；产酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1：本实验室筛选保藏；偏重亚硫酸（分析纯）：天津化学试剂三厂；柠檬酸（分析纯）：河南万恒生物科技有限公司；果胶酶（酶活3.0×104 U/g）：河南乐泰食品有限公司；白砂糖：市售。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：酵母浸膏10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨10 g/L，pH6.0，121 ℃条件下灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
FA2104N电子分析天平：上海双旭电子有限公司；HWS-12型电热恒温水浴锅：常州市金坛华伟仪器厂；PLZ-1.5型榨汁机：江苏海鸥食品机械制造公司；BKQ-B100II高压蒸汽灭菌锅：济南来宝医疗器械有限公司；PAL-1糖度仪：河北润联科技有限公司；LRH-500F生化培养箱：北京佳源兴业科技有限公司；SW-CJ-2FD双人单面垂直净化工作台：济南东仪实验室设备有限公司；PHS-3C pH计：杭州奥利龙仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程及操作要点[15-17]
将新采摘的火棘果进行流水冲洗，破碎压榨过程中注意避免果籽破碎，加入适量偏重亚硫酸钾防止果汁发生氧化褐变。将枸杞干果以1∶5（g∶g）的比例加入90～95 ℃热水中浸泡4 h，待充分吸水泡开后进行打浆处理，后与火棘果果汁混合。
果胶酶酶解：火棘果和枸杞中均含有果胶，前处理使用果胶酶酶解，可以加速出汁和促进澄清，同时减少原酒中因果胶发酵分解而带来的杂味。混合果汁中添加35 mg/L果胶酶，并在25 ℃条件下酶解1.5 h。
硫处理：果酒发酵在预处理阶段，通常要添加偏重亚硫酸钾溶液，果汁中含有一定浓度的SO2，可以达到杀菌、抗氧化、增酸、单宁物质溶出、使果酒整体风味向好的作用。混合果汁中SO2添加量为70 mg/L。
成分调整：由于混合汁的糖度相对较低，为保证发酵成品果酒酒精度，通常要用白砂糖调整混合汁的糖度使其达到21%，同时用柠檬酸调整初始发酵pH值，保证发酵过程较好启动。
菌株活化：将实验室斜面保藏的两株菌分别经过在YEPD培养基和YPD培养基上逐级接种，同时都在28 ℃恒温培养48 h进行逐级传代培养。
主发酵：将两株酵母菌按比例混合培养后接种至混合汁中，控制初始发酵糖度为21%，注意保持恒温发酵，搅拌频率为1 次/d。
后发酵：由于果渣及酵母发生沉淀，这时候可以进行倒罐发酵30 d。
陈酿：新酒一般比较粗糙，将其放在阴凉避光处，通过一定时间贮存可以使酒体变得协调。
膜分离：灌装前使用过滤膜处理酒体，可以使酒体更加澄清，稳定性更好。
消毒、灌装：灌装后使用巴氏消毒得野生火棘果保健酒。
1.3.2 野生火棘果保健果酒工艺优化单因素试验
接种量的确定：以混合果汁体积的5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%分别进行接种，于24 ℃恒温发酵至残糖为0.1%以下，以感官评分为考察指标，分析接种量对野生火棘果保健果酒品质的影响。
接种比例的确定：以产酯酵母∶耐酸酵母接种比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（V/V）分别进行接种，于24 ℃恒温发酵至残糖为0.1%以下，以感官评分为考察指标，分析接种比例对野生火棘果保健果酒品质的影响。
初始pH值的确定：用柠檬酸将发酵液初始pH值分别调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，于24 ℃恒温发酵至残糖为0.1%以下，以感官评分为考察指标，分析初始pH值对野生火棘果保健果酒品质的影响。
发酵温度的确定：分别于发酵温度为18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃的条件下恒温发酵至残糖为0.1%以下，以感官评分为考察指标，分析发酵温度对野生火棘果保健果酒品质的影响。
发酵时间的确定：分别将主发酵时间设为6 d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d、12 d，保持恒温发酵，以感官评分为考察指标，分析发酵时间对野生火棘果保健果酒品质的影响。
1.3.3 野生火棘果保健果酒发酵工艺优化
在单因素试验的基础上，根据Box-behnken的中心组合试验设计原理，选取接种量（A）、初始pH值（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4 个因素为自变量，以野生火棘果保健果酒的感官评分（Y）为响应值，采用响应面法对野生火棘果保健果酒的发酵工艺进行优化，最后对优化条件进行验证试验。响应面试验因素与水平见表1。
表1 果酒发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for wine fermentation technology optimization
1.3.4 分析检测
（1）感官评定
邀请6位果酒品评师，从酒体外观、香气、沉淀、口感四个方面对野生火棘果保健果酒进行感官评定，取平均值为每款酒最终感官评分[18]，满分100分。野生火棘果保健酒的感官评分标准见表2。
表2 野生火棘果保健果酒感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of wild Pyracantha fortuneana health wine
（2）理化指标
酒精度测定采用酒精计法；残糖量参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定[18]。
（3）微生物指标
参照GB 4789.2—2016《菌落总数测定》[19]、GB 4789.3—2016《大肠菌数测定》[20]、GB 4789.4—2016《沙门氏菌检验》[21]及GB 4789.10—2016《金黄色葡萄球菌检验》[22]。
2 结果与分析
2.1 野生火棘果保健果酒发酵条件优化单因素试验
2.1.1 接种量对野生火棘果保健果酒品质的影响
由图1可知，酵母菌接种量在5%～11%时，野生火棘果保健果酒的感官评分随着接种量的增加呈现先快速上升后缓慢下降的趋势。当接种量为9%时感官评分达到最高，为92分。原因可能是酵母菌接种量的变化，可以影响发酵的启动速率，从而影响酵母菌代谢产物和自身消解体在酒体中的含量。当接种过量时可能会导致酒体产生不良的酵母味；当接种量不足时，又会使得酒体单薄、香气不足而影响感官评分；接种量适宜时可以使得芳香类物质增多、酒体饱满平衡，从而提高酒体品质。因此，选择最佳酵母菌接种量为9%。
图1 接种量对野生火棘果保健果酒品质的影响
Fig.1 Effect of inoculum on wild Pyracantha fortuneana health wine quality
2.1.2 酵母菌接种比例对野生火棘果保健果酒品质的影响
由图2可知，随着两株酵母菌接种比例的变化，野生火棘果保健果酒的感官评分呈现先上升后下降的趋势。当产酯酵母∶耐酸酵母为1∶4（V/V）时，感官评分最高，为87分。出现上述现象的原因可能是混菌比例不同导致发酵过程中两株菌在发酵液中的数量也不尽相同，从而影响酒体中代谢产物积累，最终影响酒体的感官评分。因此，选择最佳接种比例为产酯酵母∶耐酸酵母=1∶4（V/V）。
图2 酵母菌接种比例对野生火棘果保健果酒品质的影响
Fig.2 Effect of yeast inoculum ratio on wild Pyracantha fortuneana health wine quality
2.1.3 初始pH值对野生火棘果保健果酒品质的影响
由图3可知，随着初始pH值增大，野生火棘果保健果酒的感官评分呈现出先快速升高后降低的趋势。当pH值为5.5时，感官评分最高，为88分。这可能是酵母菌生长对pH值的变化比较敏感，极端pH值条件下，酵母菌产香能力和酒精代谢能力会受到抑制，使得酒体单薄味寡，只有在最适生长pH值下，酵母菌生长代谢活跃，向着更有利于产酒精和香气的方向发展。因此，选择最佳初始pH值为5.5。
图3 初始pH值对野生火棘果保健果酒品质的影响
Fig.3 Effect of initial pH on wild Pyracantha fortuneana health wine quality
2.1.4 发酵温度对野生火棘果保健果酒品质的影响
由图4可知，随着发酵温度升高，野生火棘果保健果酒感官评分呈现先上升后下降的趋势，发酵温度为22 ℃时，感官评分最高，为93分。感官评分最高时的发酵温度却不是酵母菌的最适生长温度，原因是当进行低温发酵时，可以有效将酵母菌代谢的香气成分保留在酒体中，使得酒体宜人也不粗糙，低温发酵已经是一种趋势。因此，选择最佳发酵温度为22 ℃。
图4 发酵温度对野生火棘果保健果酒品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on wild Pyracantha fortuneana health wine quality
2.1.5 发酵时间对野生火棘果保健果酒品质的影响
由图5可知，随着发酵时间延长，野生火棘果保健果酒感官评分呈现先快速增大再缓慢下降的趋势。第8天时，野生火棘果保健果酒的感官评分最高，为93分。这是由于当发酵时间较短时，发酵进行不充分，残糖含量较高，酒精度和香气成分还积累不够，从而影响感官评分；当发酵时间过长时，发酵液环境恶化，不利于酵母菌生长繁殖，这时候酵母菌可能会大量自溶或者代谢不良产物，从而影响酒体感官评分。因此，选择最佳发酵时间为8 d。
图5 发酵时间对野生火棘果保健果酒品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on wild Pyracantha fortuneana health wine quality
2.2 响应面法优化发酵条件
2.2.1 响应面试验方案设计及试验结果
鉴于单因素试验结果，选取接种量（A）、初始pH值（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）等4个因素为自变量，以野生火棘果保健果酒感官评分（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面优化试验，试验结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 野生火棘果保健果酒发酵工艺优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for wild Pyracantha fortuneana health wine fermentation technology optimization
续表
2.2.2 回归模型的建立与方差分析
根据Box-Benhnken试验设计原理，以感官评分为响应值，利用Design-Expert.V8.06对表3试验数据分析，得回归方程：Y=94.00+2.00A+0.17B-3.42C+3.92D+0.75AB-2.50AC-2.25AD+0.50BC+1.75BD-2.75CD-4.92A2-3.67B2-11.54C2-6.04D2
由表4可知，模型极为显著（P＜0.001）。决定系数R2=0.972 7，校正决定系数R2Adj=0.945 3，失拟项P=0.214 3＞0.05，不显著，综上说明回归方程拟合度较好，自变量与响应面之间线性关系显著，可有效对野生火棘果保健果酒感官评分进行理论预测。本模型中A、C、D、A2、B2、C2、D2对结果影响差异极显著（P＜0.01），AC、AD、CD对结果影响差异显著（P＜0.05），其余项差异为不显著（P＞0.05）。根据表4的方差分析对野生火棘果保健果酒感官评分影响程度依次为：D＞C＞A＞B，即发酵时间＞发酵温度＞接种量＞初始pH值。
表4 响应面试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiments
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
图6 各因素交互作用对野生火棘果保健果酒感官评分影响的响应面和等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory evaluation score of wild Pyracantha fortuneana health wine
在其他试验自变量因素固定不变的条件下，考察两两因素的交互作用对野生火棘果保健果酒品质的影响，用Box-Behnken试验得到的多元二次回归模型制作响应面图，结果见图6。由图6可知，响应面坡度越陡峭，表明响应值对操作条件的改变越敏感，该因素对野生火棘果保健果酒品质的影响越大；反之则表明因素对野生火棘果保健果酒品质影响越小。接种量与发酵温度、接种量与发酵时间、发酵时间与发酵温度之间的交互作用明显，其他因素之间交互作用不是很显著，这与表3中的方差分析结果是一致的。
2.2.3 最佳发酵工艺确定与验证试验
利用Design-Expert.V.8.06软件进行发酵工艺参数优化组合，预测最佳工艺条件为：接种量9.18%、初始pH值5.56、发酵温度21.58 ℃、发酵时间8.35 d，在此条件下野生火棘果保健果酒感官评分预测值为95.24分。考虑到实际情况，将最佳工艺条件参数调整为接种量为9%、初始pH值为5.5、发酵温度为22 ℃、发酵时间为8 d。在此工艺条件下进行3次平行试验取平均值实际感官评分为94.61分，与预测值偏差不大，说明回归模型能较好反应野生火棘果保健果酒的发酵工艺。
2.3 野生火棘果保健果酒品质评价
该发酵所得果酒色泽鲜艳、果香浓郁、口感醇厚、整体饱满协调。酒精度为11.5%vol～12%vol，残糖＜0.1%。细菌总数＜50 CFU/mL；大肠菌群＜3 MPN/100 mL；未检出沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌。
3 结论
本研究以实验室保藏的耐酸酵母菌株Y2-1和产酯酵母菌株T6-1为试验菌株，将野生火棘果果汁与枸杞果浆混合，调节初始糖度为21%，果胶酶添加量为35 mg/L，SO2添加量为70 mg/L，以产酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1接种比例为1∶4（V/V）进行发酵。在单因素试验基础上，以野生火棘果保健果酒感官评分为考察指标，通过Box-Behnken响应面设计优化，建立了野生火棘果保健果酒的最佳发酵工艺条件：接种量为9%，初始pH值为5.5，发酵温度为22 ℃，发酵时间为8 d。在此条件下发酵的野生火棘果保健果酒色泽鲜艳、果香浓郁、口感醇厚、整体饱满协调，酒精度为11.5%vol～12%vol，感官评分达到94.61 分。
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