微生物油脂是酵母、藻类等微生物在一定条件下将碳水化合物转化而生成的一种特殊脂肪酸甘油酸三脂[1]。其成分以C16和C18为主，可作为生物柴油的原料。利用微生物发酵生产油脂不仅成本低，而且可进行大规模培养[2]，这样便可避免为了生产生物柴油而与人争粮争地的情况[3-4]。
但现阶段微生物油脂的产量还不能满足产业化要求[5]，因此目前主要从菌种的改造[6]和发酵培养优化[7]来提高其产量。利用响应面法优化培养基来获得更高的油脂产量是一种高效可行的策略。钟琦等[8]利用响应面优化粘性酵母的发酵条件，使菌株油脂产量达到5.2 g/L；KARPAGAM R等[9]通过响应面设计，将菌株的油脂产量从365 mg/L提升至580 mg/L。
本试验以前期诱变得到的高产油脂酵母[10]为出发菌株，利用单因素试验考察菌株产油脂的碳、氮源成分及含量，并通过添加外源因子来调节油脂合成途径。再对单因素得到的最佳条件进行响应面试验，进一步优化菌株产油脂的发酵培养基成分，以期为进一步提高油脂产量提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）：实验室前期常压室温等离子体（atmospheric room temperature plasma，ARTP）诱变所得，保存于中国典型培养物保藏中心（China CenterforTypeCultureCollection，CCTCC），保藏号为CCTCC M 2018318。
1.1.2 试剂
葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、NH4C1、MgCl2、Na2SO4、氯仿、甲醇（均为分析纯）：科密欧化学试剂有限公司；酵母浸粉、酵母浸膏、麦芽浸粉、蛋白胨、琼脂粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司。
1.1.3 培养基
酵母膏胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）琼脂培养基：酵母膏1 g/L，蛋白胨2 g/L，葡萄糖2 g/L，琼脂粉2 g/L。
种子液培养基[11]：蔗糖25 g/L，酵母浸膏6 g/L，麦芽浸粉5 g/L，Na2HPO4 4 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L。
发酵培养基[12]：葡萄糖70 g/L，酵母浸粉0.75 g/L，NH4C1 0.1 g/L，MgCl2 1 g/L，Na2SO4 0.1 g/L。
1.2 仪器与设备
JJ-CT-ZA洁净工作台：苏州净化设备有限公司；SX-700自动灭菌锅、MX-307落地高速冷冻离心机：日本TOMY公司；LRH-250A生化培养箱：上海一恒科技有限公司；ZQLY-180振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种活化
将甘油管保藏的菌株用竹签接种到YPD平板培养基上，28 ℃培养2 d。
1.3.2 种子液培养
挑取平板上的单菌落接种到装液量为100 mL/250 mL种子液培养基中，并用8层纱布封口处理，在28 ℃、200 r/min的摇床中培养18 h。
1.3.3 发酵培养
将生长处于对数期的种子液，按10%的接种量，接种到基础发酵培养基中，于28 ℃、200 r/min的摇床中培养7 d。
1.3.4 生物量测定与油脂提取
将发酵培养7 d的发酵液，准确吸取30 mL于烘干称质量的离心管中，10 000 r/min离心3 min，弃上清液，加入适量去离子水重悬，离心去上清。放入100 ℃烘箱中，烘干至恒质量，计算生物量。按每克菌体加入8 mL 的8 mol/L盐酸，摇匀后室温静置1 h，再进行沸水浴加热10 min，冷却后再沸水浴5 min[13]。待温度降至室温后，加入氯仿和甲醇溶液进行多次萃取，将收集到的氯仿层蒸发除去氯仿，得到微生物油脂[14-15]。生物量和油脂产量的计算公式如下：
1.3.5 单因素试验
利用单因素试验，考察发酵培养基中的碳源（蔗糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖）、氮源（酵母浸粉、氯化铵、蛋白胨、玉米浆干粉、硫酸铵）、外源因子（乙酸钠、苹果酸）对油脂积累的影响，得出最佳的碳源、氮源与外源因子后，研究其最佳添加量。在进行单因素试验时，其他条件保持不变。
1.3.6 响应面试验对油脂积累条件的优化
表1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experimental design
结合单因素试验结果，利用Box-Behnken试验，设计3因素3水平响应面试验方案，最后对所得到的预测条件进行验证。响应面试验因素水平见表1。
2 结果与分析
2.1 皮状丝孢酵母生长曲线
图1 皮状假丝酵母生长曲线
Fig.1 Growth curve of Trichosporon cutaneum
皮状丝孢酵母的生长曲线如图1所示。由图1可知，在接种后的8 h内，菌体一直处于迟缓期，在此阶段菌体不断适应新的培养环境，菌体数量基本保持不变；在8～20 h时，菌体经过前期的适应准备，在此时期菌体此时期菌体生长速率达到最大，数量极速增长；在20 h以后，菌体生长缓慢，基本处于稳定期。因此，选择培养18 h左右生长旺盛的菌种作为转接的种子液。
2.2 培养基优化单因素试验
2.2.1 碳源种类及对皮状丝孢酵母油脂积累的影响[16]
图2 碳源种类对油脂积累的影响
Fig.2 Effect of carbon source types on oil accumulation
从图2可以看出，皮状丝孢酵母可以利用六碳糖、五碳糖、双糖等碳源进行发酵生成油脂，这将有利于其利用木质纤维素水解产物来进行生物转化。当使用葡萄糖、蔗糖、木糖发酵时，菌株的生长相差不大，但在油脂积累方面，木糖的产油能力明显低于葡萄糖，这可能与木糖的复杂代谢相关[17]。用葡萄糖培养时，菌株不管是在生物量还是油脂产量方面都高于其他碳源，这与微生物对葡萄糖的偏好性以及葡萄糖可直接糖酵解产生丙酮酸而进行油脂合成有关[18]。因此，选择葡萄糖作为碳源来进行后续的发酵培养。
2.2.2 葡萄糖添加量对皮状丝孢酵母油脂积累的影响
图3 葡萄糖添加量对油脂积累的影响
Fig.3 Effect of glucose addition on oil accumulation
从图3可以看出，在葡萄糖添加量为50～90 g/L时，随着葡萄糖添加量的增大，菌体的生物量和油脂产量都呈上升趋势。当葡萄糖添加量为50 g/L时，其油脂产量仅为2.7 g/L，油脂系数仅为5.5 g/100 g；而当葡萄糖添加量提升至90 g/L时，其油脂产量达到了7.2 g/L，油脂系数达到了8.6 g/100 g，可见葡萄糖对菌株的油脂积累有很大影响。但当葡萄糖添加量继续增大时，菌株的生物量、油脂产量均出现了降低，在葡萄糖添加量为150 g/L时，油脂系数为4.2 g/100 g，较葡萄糖添加量为90 g/L时，降低了50%，可见高浓度的葡萄糖抑制了菌株的生长和油脂积累。因此，最佳葡萄糖添加量90 g/L。
2.2.3 氮源对皮状丝孢酵母油脂积累的影响
图4 氮源种类对油脂积累的影响
Fig.4 Effect of nitrogen source types on oil accumulation
由图4可以看出，在用无机氮源培养时，菌株的生长和油脂产量均较差，仅有5.5 g/L的生物量和2.9 g/L的油脂产量，而用有机氮源进行培养时，菌株生长状况良好，而且油脂的积累量大，当氮源为玉米浆干粉时，菌株的生物量、油脂产量和油脂系数分别达到了15.2 g/L、9.3 g/L和10.3g/100 g。这可能是因为玉米浆干粉中含有丰富的蛋白质、氨基酸、无机盐和生长因子等成分[19-20]，易于被菌株利用。
2.2.4 玉米浆干粉添加量对皮状丝孢酵母油脂积累的影响
图5 玉米浆干粉添加量对油脂积累的影响
Fig.5 Effect of corn syrup dry powder addition on oil accumulation
从图5可以看出，玉米浆干粉添加量对细胞的生长有很大影响，随着玉米浆干粉的添加量增加，细胞的生物量从18 g/L提高至25 g/L。但其油脂产量并没有和生物量正相关，而是在添加量为4 g/L的玉米浆干粉添加量时油脂产量达到了最大。在玉米浆干粉添加量更高时，菌株主要表现为生物量的增加，此时，培养基中的碳源大部分用于了细胞的生长和非油脂合成代谢过程，出现了油脂产量降低的情况。这说明氮源的用量在高浓度区域时，生物量与油脂的合成属于非正相关。因此，最适玉米浆干粉添加量为4 g/L。
2.2.5 外源因子对皮状丝孢酵母油脂积累的影响[21-22]
图6 乙酸钠添加量对油脂积累的影响
Fig.6 Effect of sodium acetate addition on oil accumulation
乙酰辅酶A是脂肪酸合成和能量代谢的关键物质，乙酸钠可以为乙酰辅酶A的合成提供前体物质，从而提高乙酰辅酶A水平[23]，进而可以使脂肪酸合成有更多的底物供应[24]。由图6可知，当乙酸钠的添加量为0.1 g/L时油脂的积累有少量提高，当继续增大添加量后，乙酸钠对菌株产生了一定的毒性[25]，使菌株油脂积累能力明显下降。
图7 苹果酸对油脂积累的影响
Fig.7 Effect of malic acid addition on oil accumulation
脂肪酸合成的另一个关键物质就是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）[26]，其主要来源于苹果酸酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶。苹果酸酶可催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸，在此过程中便可生成NADPH，用于脂肪酸合成[27-28]。在培养基中添加微量的苹果酸来增加催化底物，从而产生更多的还原力，由图7可知，将苹果酸添加到培养基中对油脂积累没有明显的影响，甚至在高浓度时对微生物的油脂积累出现了抑制效果，这可能是苹果酸的添加影响了发酵液的pH。
2.3 响应面优化试验
2.3.1 响应面优化试验设计及结果
根据单因素试验的结果，选取葡萄糖添加量（A）、玉米浆干粉添加量（B）和乙酸钠添加量（C）3个因素进行响应面优化设计，以油脂产量（Y）为响应值进行试验，结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments
2.3.2 模型建立与方差分析
利用Design Expert 8.0软件对表2的结果进行回归分析，得到回归方程：Y=14.02+1.34A+0.74B-0.2C+0.95AB+0.025AC-0.025BC-2.24A2-1.48B2-0.91C2，而且决定系数R2=0.994 6表示有99.46%的数据可以用该模型来解释，调整决定系数
说明该方程的拟合性较好，可以用来进行分析。
对回归方程进行方差分析，结果见表3。由表3可看出，模型P＜0.000 1表明此模型极显著，失拟项P=0.075 9＞0.05，说明失拟项不显著。回归方程中葡萄糖和玉米浆干粉的一次项P＜0.000 1，达到了极显著的水平，说明在试验范围内这两个因素对油脂的积累有极显著性的影响。在交叉项中葡萄糖和玉米浆干粉的交互作用（AB）对油脂影响极显著（P＜0.000 1），二次项中三个因素对油脂的积累影响均极显著（P＜0.000 1）。
表3 响应面试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
2.3.3 响应面图分析
各因素交互作用对菌株发酵油脂产量结果的影响见图8。由图8可知，当3个因素中其中一个固定为零水平时，其他两个因素存在交互作用且存在一个油脂产量最大的组合点[29]。在3组交互影响的图中，可以看出当其中一个因素固定时，随着另一因素的增大，油脂产量呈现先增大后减小的趋势。
2.3.4 响应面预测与验证
对得到的回归方程求解油脂产量的极大值，得出培养基起始葡萄糖、玉米浆干粉、乙酸钠的添加量分别为：97.6 g/L、4.4 g/L、0.09 g/L时，预测的菌株油脂产量可达14.4 g/L。在此条件下进行3组平行试验，得出平均油脂产量实际值为14.4 g/L，与预测值相吻合。说明本次实验的模型对皮状丝孢酵母发酵产油脂具有一定的指导意义。
图8 各因素交互作用对油脂积累影响的响应面和等高线
Fig.8 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on oil accumulation
3 结论
本研究以微生物油脂产量为目标，通过单因素试验及响应面试验进行设计优化，建立了一个油脂产量与三个因素的数学模型，此模型能很好的拟合实验结果，其预测条件与验证实验基本吻合。得到皮状丝孢酵母发酵产油脂的最优发酵培养基为：葡萄糖97.6 g/L、玉米浆干粉4.4 g/L、乙酸钠0.09 g/L。在此条件下菌株的油脂产量达到了14.4 g/L。玉米浆干粉的加入大大促进了菌体的生长，本研究对生物油脂产业化生产提供一定科学依据。
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