β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）在自然界的多种动植物和细菌及真菌体内广泛存在[1]，可参与微生物、植物、动物和人体的大多数生化反应，其中包括碳水化合物的代谢，释放葡萄糖体和配基[2-4]，并在维持生物体的正常生理功能中起重要作用。β-葡萄糖苷酶在活细胞内产生，并可在体外参与各类反应，如水解果汁及果酒中芳香前体物质产生香气[5]，生产非离子表面活性剂烷基糖苷等[6]，从而在工业化过程中发挥重要作用[7]。
动植物来源的β-葡萄糖苷酶的培养周期较长，提取工艺相对复杂，可操作性差[8]，而通过微生物法制得的β-葡萄糖苷酶易分离纯化、价格低廉、产量高，可满足工业化应用需求[9-10]。工业上常用曲霉发酵产β-葡萄糖苷酶，但曲霉在食品卫生方面存在安全隐患[11]，而乳酸菌来源的β-葡萄糖苷酶对其相关产品的营养价值及其功能特性有双重提升作用，如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）β-葡萄糖苷酶可转化人参皂苷[12-13]、大豆异黄酮糖苷[14]。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）属于乳杆菌属（Lactobacillus），是动物肠道菌群中的重要微生物，可以调节并改善肠道中的微生态平衡[15]，还具有调节免疫[16]、减轻肥胖[17]等益生功能。目前，国内外针对微生物来源β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉菌（Trichoderma）等，而对嗜酸乳杆菌产β-葡萄糖苷酶及其相关技术研究鲜有报道，且在工业化生产中，现有β-葡萄糖苷酶产量较低且活力普遍偏低，其来源的局限性及较低的产量制约着β-葡萄糖苷酶的工业化生产及应用[18]。
因此，本试验以前期获得的β-葡萄糖苷酶活性较高的嗜酸乳杆菌GIM.1.20为研究对象，通过单因素、正交试验、响应面分析优化其产β-葡萄糖苷酶的发酵培养基及发酵条件，旨在提高β-葡萄糖苷酶产量，为嗜酸乳杆菌功能的开发以及后续β-葡萄糖苷酶的生产应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM 1.208：本实验室前期筛选获得。
1.1.2 培养基
MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物2.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，吐温80 1.0 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，碳酸钙20.0 g/L，牛肉膏浸提物10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，柠檬酸二胺2.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，七水硫酸锰0.05 g/L，蒸馏水1.0 L，pH 6.8，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
刺梨培养基：刺梨浆15 g，蒸馏水45 mL，自然pH，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.1.3 化学试剂
葡萄糖（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司；羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）（分析纯）：天津市兴复精细化工研究所；无水乙酸钠（分析纯）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；盐酸（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市盛鑫源伟业贸易有限公司；碳酸钠（分析纯）：重庆江川化工（集团）有限公司；对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）（纯度＞98%）：天津市科密欧化学试剂有限公司；4-硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）（纯度＞98%）：美国Sigma公司。
1.2 仪器与设备
E-201-C-9 pH复合电极：上海鸿盖仪器有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备；101-3A电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；LD2X-50KBJ立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；L5S紫外-可见分光光度计：上海仪器分析仪器有限公司；SPECTRAMAX 190全波长光吸收酶标仪：美国MolecularDevices公司；TGLIOM台式高速冷冻离心机：长沙迈佳森仪器设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 嗜酸乳杆菌GIM1.208菌液的制备[19]
将Lactobacillus acidophilus GIM1.208接种于MRS培养基，37 ℃静置培养48 h。吸取1 mL已活化的嗜酸乳杆菌接种于5mLMRS培养基中，37℃静置培养24h，作为种子液备用。
1.3.2 β-葡萄糖苷酶活力的测定
将种子液接种于培养基，37 ℃静置培养24 h，取菌液于10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液，稀释至一定倍数，采用p-NPG法测定β-葡萄糖苷酶酶活[20-21]。
β-葡萄糖苷酶酶活定义：在37 ℃、pH 5.0反应条件下，1 mL粗酶液酶解p-NPG 1 min产生1 μmol p-NP的酶活力，定义为一个酶活力单位，以U/mL表示。
1.3.3 嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶发酵培养基的
筛选
将种子液按2%（V/V）接种量分别接种于MRS培养基和刺梨培养基，37 ℃静置培养24 h，测定β-葡萄糖苷酶活力，考察两种培养基对Lactobacillus acidophilus GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响。
1.3.4 嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶发酵培养基优化
确定发酵培养基后，以葡萄糖为碳源[22-23]，考察葡萄糖添加量（0、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、初始pH值（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）、CMC-Na添加量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）[24]对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响。初始发酵条件为接种量2%，料液比为1∶3（g∶mL），自然pH，37 ℃发酵24 h。
在单因素试验的基础上，以β-葡萄糖苷酶活力（Y）为评价指标，选择葡萄糖添加量（A）、初始pH值（B）及CMC-Na添加量（C）进行3因素3水平正交试验，因素与水平见表1。
表1 发酵培养基优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation medium optimization
1.3.5 嗜酸乳杆菌GIM1.208产B-葡萄糖苷酶发酵条件优化
采用单因素轮换法依次考察刺梨浆与水料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL））、发酵温度（25 ℃、27 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃）、发酵时间（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）及接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响。初始发酵条件为接种量2%，刺梨浆与水料液比1∶3（g∶mL），自然pH，培养24 h。
在单因素试验结果基础上，以β-葡萄糖苷酶活力（Y）为评价指标，选取对结果影响显著的因素发酵温度（D）、接种量（E）、刺梨浆与水料液比（F）进行3因素3水平Box-Behnken试验，因素与水平见表2。
表2 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization
1.3.6 数据处理
每次试验重复3次；采用SPSS 22.0软件进行显著性分析，Design-Expert8.0.6软件设计响应面试验方案，建立数学模型并进行多元回归分析，Excel 2016制图。
2 结果与分析
2.1 嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶培养基筛选
利用MRS肉汤培养基和刺梨果培养基发酵嗜酸乳杆菌GIM 1.208产β-葡萄糖苷酶，研究发现，发酵24 h后，刺梨发酵培养基中β-葡萄糖苷酶活力为（3.997±0.303）U/mL，高于MRS肉汤培养基中β-葡萄糖苷酶活力[（1.770±0.203）U/mL]，这可能与刺梨自身含有丰富的营养物质有关，这类物质可作为嗜酸乳杆菌GIM1.208发酵产β-葡萄糖苷酶的诱导物[25]，促进嗜酸乳杆菌GIM1.208产酶。因此，选用刺梨培养基作为最适产酶培养基。
2.2 发酵培养基优化
2.2.1 葡萄糖添加量对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
有研究发现，葡萄糖可改变β-葡萄糖苷酶的作用位点而增强酶活[26]，因此，选择葡萄糖作为碳源，考察葡萄糖添加量对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响，结果见图1。由图1可知，当葡萄糖添加量为3%时，β-葡萄糖苷酶活力最高，为5.92 U/mL，分析原因可能是β-葡萄糖苷酶活性与发酵体系静电性质和酶结构相关[27]，因此，选择葡萄糖3%作为碳源补充。
图1 葡萄糖添加量对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.1 Effect of glucose addition on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.2.2 初始pH值对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
由图2可知，随着初始pH值的升高，β-葡萄糖苷酶活力呈现先升高后下降的趋势，当初始pH值为6.5时，β-葡萄糖苷酶活力达到最大，为5.54 U/mL。分析原因可能是随着发酵体系初始pH值的变化，酶的活性位点发生变化，对酶与底物的结合有影响，降低其活性[26]。因此，选取培养基初始pH值为6.5。
图2 初始pH值对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.2 Effect of initial pH on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.2.3 羧甲基纤维素钠对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
β-葡萄糖苷酶是诱导酶类，可溶性CMC-Na有助于β-葡萄糖苷酶活性的提高[23，28]。由图3可知，随着CMC-Na添加量的增加，β-葡萄糖苷酶活力呈先升高后降低的趋势，当CMC-Na添加量为0.4%时，酶活力最高，为6.13 U/mL。因此，选择CMC-Na添加量为0.4%。
图3 羧甲基纤维素钠添加量对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.3 Effect of carboxymethylcellulose sodium addition on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.2.4 发酵培养基优化正交试验结果与分析
发酵培养基优化正交试验结果与分析见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵培养基优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation medium optimization
续表
表4 正交试验结果的方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。下同。
由表3可知，各因素对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响的主次顺序为A＞C＞B，即葡萄糖添加量＞CMC-Na添加量＞初始pH值，最优试验组合为A2B1C2，即葡萄糖添加量3.0%，培养基初始pH值5.5，CMC-Na添加量0.4%。在此优化条件下，β-葡萄糖苷酶活力为9.72 U/mL。由表4可知，补充葡萄糖和诱导物CMC-Na对产酶效果具有显著性影响（P＜0.05），而初始pH值对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.3 发酵条件的优化
2.3.1 料液比对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
水分会影响发酵过程中胞外酶的合成与分泌[29]。由图4可知，当刺梨浆与水料液比为1∶1～1∶4（g∶mL）时，β-葡萄糖苷酶活力逐渐升高；当料液比为1∶4（g∶mL）时，β-葡萄糖苷酶活力达到最大，为12.35 U/mL；当料液比＜1∶4（g∶mL）之后，β-葡萄糖苷酶活力呈现下降趋势。因此，选择最佳料液比为1∶4（g∶mL）。
图4 料液比对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.4 Effect of material to liquid ratio on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.3.2 发酵温度对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
由图5可知，当发酵温度为25～30 ℃时，随着发酵温度的升高，嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的能力呈上升趋势，这可能是因为温度升高提高了质膜的通透性和代谢反应的速度[30]，利于细胞内外环境之间的养分运输和产物交换。当发酵温度为30 ℃时，其酶活性达到最大值，为15.15 U/mL。当发酵温度高于30 ℃之后，β-葡萄糖苷酶活力下降[31-32]。因此，选择最佳发酵温度为30 ℃。
图5 发酵温度对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.5 Effect of fermentation temperature on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.3.3 发酵时间对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
由图6可知，当发酵时间＜24 h之前，酶活性增加；当发酵24 h时，酶活力达到最大，为15.33 U/mL；当发酵时间＞24 h之后，酶活性呈现缓慢降低趋势。此时微生物生长至衰亡期，代谢减弱、酶活性降低，且发酵后期，微生物次级代谢产物不断积累，抑制了嗜酸乳杆菌产酶而降低酶活性[33]。因此，选择最佳发酵时间为24 h。
图6 发酵时间对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.6 Effect of fermentation time on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.3.4 接种量对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
接种量过少或过多都不利于β-葡萄糖苷酶的合成[20，34]。由图7可知，当接种量＜2.5%之前，β-葡萄糖苷酶活力逐渐升高；当在接种量为2.5%时，β-葡萄糖苷酶活性达到最大，为15.85 U/mL；当接种量＞2.5%之后，随着培养基内部营养物质的匮乏，β-葡萄糖苷酶活力缓慢减小。因此，选择最佳接种量为2.5%。
图7 接种量对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的影响
Fig.7 Effect of inoculum on β-glucosidase production by Lactobacillus acidophilus GIM1.208
2.3.5 Box-Behnken响应面试验结果与分析
发酵条件优化响应面试验结果与分析见表5，方差分析见表6。
表5 发酵条件优化Box-Behnken试验结果与分析
Table 5 Results and analysis of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization
采用Design Expert 8.0.6软件对表5的结果进行多元二次回归拟合，得到β-葡萄糖苷酶活力（Y）与发酵温度（D）、接种量（E）、料液比（F）的二次多项回归方程：Y=-86.43+3.94D+16.16E+10.45F+0.05DE-0.01DF+0.17EF-0.06D2-3.61E2-1.30F2。
表6 回归模型的方差分析
Table 6 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
由表6可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明回归方程拟合效果较好，模型选择恰当。决定系数R2=0.952 0，调整决定系数R2Adj=0.988 0，说明预测值与实际测定值间存在较好的相关性，模型选择正确，可用此模型对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的发酵产酶条件进行预测。一次项D及二次项D2、E2、F2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项E对结果影响显著（P＜0.05），而其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
采用Design Expert 8.0.6软件对模型进行优化求解，以β-葡萄糖苷酶活力为响应值，得到嗜酸乳杆菌产β-葡萄糖苷酶的最优发酵条件为发酵温度31.24 ℃、接种量2.57%、料液比1∶4.02，在此最优条件下，最大酶活力预测值为16.81 U/mL。为便于实际操作，将最优发酵条件修订为发酵温度31 ℃、接种量2.6%、料液比1∶4（g∶mL），在此最优条件下重复试验6次，得到β-葡萄糖苷酶活力实际值为16.80 U/mL，与模型预测值相近，可知该模型对嗜酸乳杆菌产β-葡萄糖苷酶的情况有较为准确的预测，证明了响应面优化对嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的发酵生产具有一定的指导意义。
3 结论
通过单因素试验及正交试验确定嗜酸乳杆菌GIM1.208产β-葡萄糖苷酶的最佳培养基组成为葡萄糖添加量3.0%，羧甲基纤维素钠添加量0.4%，初始pH值5.5；通过单因素试验及响应面试验确定最佳发酵条件为发酵温度31 ℃，发酵时间24 h，接种量2.6%，料液比1∶4（g∶mL）。在此最优条件下，β-葡萄糖苷酶活力达16.80 U/mL，是优化前酶活力（4.30 U/mL）的3.90倍。本试验结果为今后通过生物技术手段产β-葡萄糖苷酶应用于工业生产提供了新的候选菌株，并为嗜酸乳杆菌功能及应用价值的提升提供了理论参考。
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