刺葡萄（Vitis davidii Foex）是葡萄科葡萄属东亚种群的一种野生种质资源，原产于湖南、云南、广东、江西、浙江等省[1-2]，刺葡萄典型特征在于新梢、叶柄及叶脉上密生刺状物[3]，耐湿热且抗病性强[3-6]。据统计，目前湖南省刺葡萄产量约25.5万L，多用于鲜食，其果实采后加工处于初级阶段，极大制约了刺葡萄产业的发展[7]。近年来，刺葡萄产业的重心逐渐由鲜食开始向酿制刺葡萄酒、加工刺葡萄汁和保健品等方向转移[8]，尤其是刺葡萄酒的开发。刺葡萄果实皮厚籽多，具有较好的酿酒潜力，研究开发刺葡萄酒将极大地提升原料的经济价值，目前已有一些关于刺葡萄酿酒特性及刺葡萄酒的报道[9-11]。刺葡萄作为中国本土的种质资源，刺葡萄酒风格的挖掘和形成对中国葡萄酒产业的发展具有重要意义。
目前，关于野生刺葡萄种质资源利用的研究主要集中在其抗病性、鲜食品质改良[2]和保健品提取纯化[12]等方面，而关于其酿酒特性，尤其是香气方面的研究鲜有报道。香气是评判葡萄酒品质的一个重要感官指标[13]，香气物质的种类和含量对葡萄酒的风格和典型性起决定作用。MENG J F等[9]研究表明，C6类化合物是刺葡萄果实中的主要挥发性成分，此外还可分离出一些其他葡萄属中未见报道的化合物，如香叶基丙酮、对甲氧基苯酚和丁香酚等；在刺葡萄酿酒品质方面，鲍瑞峰等[10]研究表明，醇类、酯类物质是刺葡萄酒中最主要的挥发性组分[13]，花香、果香、焦糖味是刺葡萄的主要特征香气[14]。但已报道文献未对刺葡萄酒挥发性组分进行准确定量，不利于将刺葡萄酒与其他品种葡萄酒的香气进行比较。本研究选取用湖南省内常见的3个刺葡萄品种酿制干红葡萄酒（米葡萄、涩葡萄和甜葡萄）为试材，采用气相色谱-质谱联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）进行刺葡萄酒挥发性组分的检测，并采用内标标准曲线法对检出组分进行准确定量，结合香气活性值（odor activity values，OAV）分析的方法，研究刺葡萄酒主要呈香物质和香气特征，以期为酿造优质刺葡萄酒提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
米葡萄、涩葡萄和甜葡萄干红刺葡萄酒样品：湖南怀化市中方县农业局；NaCl、NaOH、酒石酸、葡萄糖（均为分析纯）：北京化学试剂公司；乙醇（色谱纯）：百灵威科技有限公司；挥发性化合物标准品、C6～C24正构烷烃：美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
DVB/CAR/PDMS顶空固相微萃取纤维头：美国Supelco公司；Agilent 6890 GC气相色谱与Agilent 5975C MS质谱联用设备：美国Agilent公司；HP-INNOwax气相色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国J&W Scientific公司。
1.3 实验方法
1.3.1 刺葡萄酒挥发性组分检测方法
采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）与气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）相结合进行挥发性组分分析，检测方法和仪器参数设定参照文献[15]。
前处理方法：在20 mL样品瓶中准确加入1.00 g NaCl、5 mL样品、10 μL 4-甲基-2-戊醇水溶液（内标，1.038 8 g/L）和转子，在40 ℃条件下加热30 min，同时以500 r/min转速进行搅拌；将已活化的萃取纤维头插入样品瓶的顶空，40 ℃条件下加热30 min。每个样品两次重复。
GC-MS条件：气相色谱与质谱联用设备载气为氦气（He），流速为1 mL/min；进样口温度为250 ℃，解吸时间8 min，采用不分流模式进样；程序升温设定为初始温度50 ℃，保持1 min；以3 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min。离子源为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，质量扫描范围为30～350 m/z。辅助加热区温度、离子源温度和四极杆温度分别为250 ℃、230 ℃和150 ℃。
定性定量：挥发性组分的定性分析采用自动质谱图解卷积和鉴定系统（AMDIS）软件进行峰识别，结合标准品质谱信息、美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）2011质谱数据库及相应的保留指数建立刺葡萄酒香气数据库（MSL library）。定量分析采用内标标准曲线法[14]，对于已有标准品的挥发性组分利用其相应的标准曲线来进行定量，没有标准品的物质利用化学结构相似、碳原子数相近、官能团相似的香气标准品的标准曲线进行半定量。
1.3.2 数据处理
香气活性值（OAV）计算：香气值也称香气活性值，是评价挥发性化合物对体系香气贡献大小所普遍采用的一个指标，由化合物质量浓度除以其嗅觉阈值得到，其计算公式如下：
式中：Ci为化合物i在样品中的质量浓度，μg/L；OTi为化合物i在水或模拟溶液中的嗅觉阈值[16]，μg/L。
采用SPSS 20.0进行统计分析，方差分析采用Duncan法，显著性水平P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 刺葡萄酒挥发性物质组成
在3个品种刺葡萄酒中共检测到90种挥发性组分，结果见表1。由表1可知，在3个品种刺葡萄酒中都能检出的物质有68种，包括高级醇类物质13种、酯类26种、萜烯类3种、降异戊二烯类6种等。3个品种刺葡萄酒中各类挥发性组分构成比例相似，都以高级醇类物质为主，占挥发性物质总量69.28%～88.86%。酯类化合物占挥发性组分总量的10.18%～30.56%，是刺葡萄酒中第二类含量较高的物质。其他物质所占挥发性物质总量比例较低。
表1 3个品种刺葡萄酒挥发性组分含量测定结果
Table 1 Determination results of volatile components contents in the 3 cultivars of Vitis davidii Foex wines
续表
续表
注：1.定性化合物的方式：A通过与标准品信息比照定到的化合物；B指通过与NIST数据库信息比对定到的化合物；2.化合物类型后所显示的是该香气化合物在总量中所占的比例；3.显著性差异分析：采用SPSS 20.0进行统计分析，方差分析采用Duncan法，数据后小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；4.“nd”代表未找到该化合物；“tr”代表该化合物含量甚微，难以准确定量；5.该物质在刺葡萄酒的色谱图中表现为相邻的两个峰，根据其质谱信息推测为同一物质的不同构型，依据出峰时间分别标注为Vitispirane A和Vitispirane B。
2.2 刺葡萄酒呈香物质分析
化合物在体系中OAV＞1能被人感知[17-18]。3个品种刺葡萄酒中检测到OAV＞1的物质共有21种（见表2），包含高级醇类3种、酯类12种、醛酮类2种、挥发性酚类2种、含硫化合物1种以及降异戊二烯类1种。其中β-大马士酮、乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、异戊醇、3-甲硫基丙醇等物质对刺葡萄酒呈香贡献较大（OAV＞10）。
表2 3个品种刺葡萄酒中挥发性物质的香气活性值、阈值和香气描述
Table 2 OAV,threshold value and odor description of the 3 cultivars of Vitis davidii Foex wines
注：在每个品种刺葡萄酒样品中OAV都小于1的物质未列入此表中；香气化合物类型：1为果香；2为花香；3为植物味；4为甜香；5为烘烤味；6为香料香；7为化学味；8为脂肪味。
2.2.1 高级醇类物质
高级醇类物质是酵母酒精发酵的副产物，这类物质常具有较为强烈的刺激性气味，根据其含量的不同影响葡萄酒的整体香气[25]。在刺葡萄酒中共检测到高级醇类物质16种，含量范围为658.0 mg/L（米葡萄）～904.2 mg/L（甜葡萄），是含量最高的挥发性组分（表1）。该结果与文献报道采用液-液萃取法提取得到的实验结果一致[10]。其中有3种高级醇类物质香气活性值（OAV）＞1，分别为异戊醇（16.90～19.44）、异丁醇（2.20～6.09）和β-苯乙醇（2.98～4.54）（表2）。异戊醇、异丁醇带有酒精味、指甲油味等化学溶剂气味，β-苯乙醇带有玫瑰、蜂蜜香气。同种检测方法下，赤霞珠干红葡萄酒挥发性组分中高级醇类占60.9%[26]，异戊醇含量突出占43.4%～55.0%，β-苯乙醇占8.2%～13.5%[27]；美乐干红葡萄酒中高级醇类物质占70%[17]，与刺葡萄酒高级醇类物质构成比例较为相似。
2.2.2 酯类物质
葡萄酒中的酯类物质主要分为脂肪酸乙酯类、高级醇乙酸酯类和其它酯类，酯类物质含量常超过感官阈值，赋予葡萄酒果香、甜香等风味[28]。检测到刺葡萄酒中酯类化合物34种，其中支链脂肪酸乙酯和2-羟基-4-甲基戊酸乙酯，分别贡献葡萄酒的红色浆果香和黑色浆果香[29-30]。高级醇乙酸酯类物质主要包括乙酸异戊酯、乙酸己酯和乙酸苯乙酯。这些物质常赋予葡萄酒香蕉、梨和花香等香气。此外，含量较高的酯类物质有乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸异戊酯等（表1）。
在酯类物质组成方面，刺葡萄酒与赤霞珠干红[26]、美乐干红[17]有较大差异。刺葡萄酒挥发性组分中含有一些香气活性值（OAV）较大的酯类物质，如乙酸乙酯（16.24～30.18）呈现热带水果、香料、熟透的苹果等香气；乳酸乙酯（5.64～19.54）带有花香、奶酪味、覆盆子香气；己酸乙酯（7.10～15.81）带有香蕉、青苹果香；辛酸甲酯（3.22～5.16）呈现菠萝味；乙酸异戊酯（1.87～4.92）呈现典型的香蕉香气等。这些物质赋予刺葡萄酒香蕉、菠萝、草莓等水果香气以及甜香和花香。
2.2.3 其他物质
刺葡萄酒中检测到8种降异戊二烯类物质，降异戊二烯类物质由类胡萝卜素降解产生，常赋予葡萄酒花香和果香[31]；在葡萄果实中，这类物质主要以糖苷结合态形式存在，在酿造过程中可在酸性条件或是糖苷酶作用下水解释放[31]。Vitispirane带有香樟树气味，TDN带有煤油味[32]。β-大马士酮在刺葡萄酒中OAV为71.82～108.47（表2），该物质呈现花果类香气，常被描述为烤苹果香、花香、蜜香、木质香[19]等。
C6类物质主要贡献葡萄酒“生青味”、“青草味”，刺葡萄酒中检测到4种C6类物质。C6类化合物是刺葡萄果实中的主要挥发性成分[9]，但是该类物质在刺葡萄酒中的含量并不突出。刺葡萄酒中C6类物质相对含量最高为0.07%（表1），低于赤霞珠干红葡萄酒（2.7%）[26]。
挥发性酚类物质在葡萄酒中的含量通常高于自身的感官阈值，从而极易影响和修饰葡萄酒的风味。在刺葡萄酒中检测到4种挥发酚类物质，其中丁香酚和愈创木酚OAV＞1，丁香酚带有肉桂、丁香、香料香气；愈创木酚带有烟熏和焙烤风味。该结果与MENG J F等[9]的研究结果相符。
此外，3-甲硫基丙醇具有较大香气值，在甜葡萄中香气值为12.11（表2），带有熟土豆、熟蔬菜等植物类香气。
2.3 刺葡萄酒香气轮廓分析
将具有相同香气类型的物质分为8组，分别为果香、花香、植物味、甜香、焦糖味、香料香、化学味和脂肪味，依据各类香气的OAV总和绘制香气轮廓图，结果见图1。
图1 3个品种刺葡萄酒香气轮廓图
Fig.1 Aroma profile of the 3 cultivars of Vitis davidii Foex wines
由图1可知，3个品种刺葡萄酒的香气轮廓具有较高的相似性，都主要呈现出果香、甜香和花香。结合表2分析可知，β-大马士酮具有最高香气值，贡献了刺葡萄酒大部分的果香、甜香和花香风味。3个品种刺葡萄酒中，由于β-大马士酮含量差异造成了甜葡萄酒在果香、甜香和花香这3种类型香气丰度最低。此外，米葡萄酒中一些乙酯类物质含量显著较高，如乙酸乙酯、乳酸乙酯、庚酸乙酯等（见表1），由于这些酯类物质都能贡献果香，使得米葡萄酒呈现果香最为突出。
3 结论
3个品种（‘米葡萄’、‘甜葡萄’、‘涩葡萄’）湖南刺葡萄酒样中共检测到90种挥发性物质，其中高级醇类占挥发性物质总量的69.28%～88.86%，是湖南刺葡萄酒的主要挥发性组分。OAV分析结果表明，β-大马士酮（71.82～108.47）、乙酸乙酯（16.24～30.18）、乳酸乙酯（5.64～19.54）、己酸乙酯（7.10～15.81）、异戊醇（16.90～19.44）和3-甲硫基丙醇（6.74～12.11）在湖南刺葡萄酒中OAV＞10，是湖南刺葡萄酒的主要呈香物质。香气轮廓分析表明，湖南刺葡萄酒的香气轮廓具有较高相似性，主要呈现果香、花香和甜香。其中甜葡萄酒果香、甜香和花香较弱，米葡萄酒中果香较突出。
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