冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又名“金花菌”，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种灰绿色曲霉真菌[1]，广泛存在于土壤、茯砖茶、冬虫夏草、中药片和木屑中。冠突散囊菌是茯砖茶发酵过程中的优势菌种[2]，可作为产生多种胞外酶（多酚氧化酶、果胶酶、纤维素酶、蛋白酶等）、胞外多糖和色素等的生产菌株[3-5]。冠突散囊菌属具有典型颜色的闭囊壳，在马铃薯培养基上或其他培养基上生长时通常会代谢产生大量的色素物质[6]，其主要色素为黄色素，随着培养时间的延长会伴随着黑色素的产生。黑色素（melanin）是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称[7]，其通常与蛋白质、碳水化合物等络合形成不同类型的生物大分子物质，广泛存在于动物、植物和微生物中[8]。黑色素一般难溶于水、酸和有机溶剂，易溶于碱溶液[9]，具有抗氧化[10-12]、抗辐射[13]、抗癌[14-15]、免疫调节[16-18]等作用，在医学、药学、日用化工、食品及其他领域有很大的应用潜力。
本试验拟采用响应面试验设计的方法对冠突散囊菌胞外黑色素的提取条件进行优化，并探讨各因素之间交互作用对黑色素提取量的影响，旨在为微生物源天然功能性色素的开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：由湖南安化白沙溪茶厂的茯砖茶中分离获得。氢氧化钠、浓盐酸（均为分析纯）：由国药集团化学试剂有限公司。其他试剂为国产分析纯。
冠突散囊菌液态基础培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸馏水1 L。
1.2 仪器与设备
ZQPL-200全温振荡培养箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；LMQC型立式灭菌锅：山东新华医疗器械股份有限公司SW-CJ-2G双人单面（水平）净化工作台：江苏通净净化设备有限公司；TP-620A电子天平：湘仪天平仪器设备有限公司；XMTD 数显恒温水浴锅：上海浦东物理光学仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；FD-1A-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；CF16RXⅡ型高速冷冻离心机、UH5300型分光光度计：日本株式会社日立高新技术科学有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 冠突散囊菌胞外黑色素发酵液的制备
黑色素发酵液的制备：取活化后的冠突散囊菌菌种接种于装有120 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，置28 ℃摇床中180 r/min培养10 d，过滤得冠突散囊菌发酵液。
1.3.2 黑色素的提取及含量的测定
黑色素的提取：准确量取冠突散囊菌发酵液50 mL，加入一定量的NaOH溶液，在一定温度水浴中搅拌提取，趁热过滤，再酸沉（用6 mol/L盐酸调滤液至一定pH后置于一定温度水浴中静置4 h，使冠突散囊菌胞外黑色素絮凝使其沉淀），然后离心去上清液得到黑色沉淀物，用蒸馏水洗至中性，冷冻干燥后的到黑色素粗品，依次采用乙酸乙酯、氯仿和乙醇分别对黑色素粗品进行萃取提纯，冷冻干燥后得到冠突散囊菌胞外黑色素。
黑色素含量的计算公式如下：
式中：M为提取得到的黑色素质量，mg；V为发酵液体积，mL。
1.3.3 冠突散囊菌胞外黑色素提取单因素试验
NaOH浓度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响：准确量取冠突散囊菌发酵液100 mL，固定提取温度为50 ℃，酸沉pH值为2，发酵液与NaOH体积比（料液比）1∶1.0（V/V），分别测定NaOH浓度为0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2 mol/L对冠突散囊菌黑色素含量的影响。每个处理组3个重复。
提取温度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响：准确量取冠突散囊菌发酵液100 mL，固定NaOH浓度为1.0mol/L，酸沉pH值为2，料液比为1∶1.0（V/V），分别测定提取温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃对冠突散囊菌黑色素含量的影响。每个处理组3个重复。
酸沉pH对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响：准确量取冠突散囊菌发酵液100 mL，固定NaOH浓度为1.0 mol/L，提取温度为50 ℃，料液比为1∶1.0（V/V），分别测定酸沉pH为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5对冠突散囊菌黑色素含量的影响。每个处理组3个重复。
料液比对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响：准确量取冠突散囊菌发酵液100 mL，固定NaOH浓度为1.0 mol/L，提取温度为50 ℃，酸沉pH为2.0，分别测定料液比为1∶0.5、1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0（V/V）对冠突散囊菌黑色素含量的影响。每个处理组3个重复。
1.3.4 响应面法对冠突散囊菌黑色素碱法提取工艺的优化
在单因素试验结果基础上，以NaOH浓度（A）、提取温度（B）、酸沉pH（C）和料液比（D）作自变量，进行响应面试验，以冠突散囊菌黑色素含量（Y）为响应值，确定碱法提取冠突散囊菌黑色素的最佳工艺参数。试验因素水平编码见表1。
表1 黑色素提取工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for melanin extraction process optimization
1.3.5 数据分析
利用Origin 8.5、Design-Expert 8.0和SPSS 18.0数据处理系统对试验结果进行分析。
2 结果与分析
2.1 NaOH浓度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
由图1得知，随着NaOH浓度的增大，黑色素含量也不断增大，当NaOH浓度增大至1.0 mol/L时取得最大值1.248 mg/mL，此后黑色素含量随着NaOH浓度的增大而减小，可能是因为NaOH浓度的增大可以提取更多的黑色素，但浓度过高时，可能会浸提出发酵液中的其他成分，这些成分与黑色素发生反应，不利于黑色素的提取[19-21]。因此，最适NaOH浓度为1.0 mol/L。
图1 NaOH浓度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
Fig.1 Effect of NaOH concentration on extracellular melanin contents of Eurotium cristatum
不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 提取温度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
由图2得知，随着提取温度的升高，黑色素含量也不断增大，当提取温度升高至70 ℃时取得最大值1.821 mg/mL，此后黑色素含量随着提取温度的升高而减小，可能是由于当提取温度过高时，冠突散囊菌胞外黑色素的高分子结构遭到破坏导致提取效果不佳[22]，而且过高的温度可能会造成蛋白质、脂质等杂质的溶出，给黑色素进一步的纯化带来影响[23]。因此，最适提取温度为70 ℃。
图2 提取温度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on extracellular melanin contents of Eurotium cristatum
2.3 酸沉pH对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
由图3得知，随着pH的升高，黑色素含量也不断增大，当pH为2.5时取得最大值2.006 mg/mL，此后黑色素含量随着pH的升高而减小，可能是由于当pH＜2.0时，冠突散囊菌胞外黑色素在强酸条件下不稳定结构遭到破坏，当pH＞3.0时，不能将黑色素全部沉降析出[24]，故过高或过低的酸沉pH都不利于冠突散囊菌黑色素的提取。因此，最适酸沉pH值为2.5。
图3 色素酸沉pH值对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
Fig.3 Effect of acid pigment deposition pH value on extracellular melanin content of Eurotium cristatum
2.4 料液比对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
由图4得知，随着料液比的变化，黑色素含量也不断增大，当料液比为1∶1.0（V/V）时取得最大值1.534 mg/mL，当料液比为1∶1.0（V/V）时黑色素含量与料液比为1∶1.0（V/V）时无显著差异，此后黑色素含量随着料液比的变化而减小，可能是由于当提取溶剂过少时，短时间内黑色素的溶解达到平衡，不利于黑色素的溶出[25]，提取溶剂过多时，可能会溶出其他杂质，影响下一步的酸沉[26]。因此，最适料液比为1∶1.0（V/V）。
图4 发酵液与NaOH溶液对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响
Fig.4 Effect of fermentation broth to NaOH ratio on extracellular melanin content of Eurotium cristatum
2.5 响应面试验
以NaOH浓度（A）、提取温度（B）、酸沉pH（C）和料液比（D）为自变因素，黑色素含量（Y）为响应值，采用Design-Expert 8.0软件进行响应面试验设计方法优化提取条件，结果见表2。
表2 黑色素提取工艺优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface methodology for melanin extraction process optimization
利用Design-Expert 8.0软件对响应面结果进行多元回归拟合，对表2的数据进行回归分析，得到的模型为多项回归方程，得到二次多项回归方程：
为了检测以上方程的可靠性，对上述回归模型进行方差分析，并对模型系数进行显著性检验，结果见表3。由表3方差分析结果可知，模型的F=68.12，P＜0.000 1差异极显著，并且失拟项P=0.472 2＞0.05，故说明该模型是显著的。由表3可知，NaOH浓度、提到温度、酸沉pH和料液比对含量影响均显著（P＜0.05）；对含量影响程度为B（提到温度）＞D（料液比）＞A（NaOH浓度）＞C（酸沉pH）。交互项AB、AD、BD、CD对结果影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）。
响应面优化模型因素（NaOH浓度、提取温度、酸沉pH和料液比）两两交互作用对含量影响的响应面及等高线见图5。
响应面及等高线的形状可以分析出随着各因素水平的升高或延长，冠突散囊菌胞外黑色素含量均呈现先增大后减少的变化特征。并且，响应面走势的陡峭程度和等高线的形状可以出反应两因素之间作用的显著程度。其中，响应面走势越陡，等高线的形状越偏向椭圆表明两因素之间的交互作用越显著。由图5可知，温度和料液比之间的交互作用最显著，且等高线沿提取温度轴变化更加密集，而沿料液比轴变化相对稀疏，最后结合响应面的陡峭程度得出提取温度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响要大于料液比。同理可以得出酸沉pH对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响要低于NaOH浓度，而NaOH浓度对冠突散囊菌胞外黑色素含量的影响要低于提取温度和料液比，这与表3方差分析结果一致。
表3 响应面试验方差分析
Table 3 Variance analysis of response surface methodology
注：“*”表示差异显著（P＜0.05）；“**”表示差异极显著（P＜0.01）。
图5 各因素交互作用对冠突散囊菌胞外黑色素含量影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on extracellular melanin content of Eurotium cristatum
根据Design-Expert软件得出在NaOH浓度、温度、pH和料液比交互影响下，最优提取工艺为NaOH浓度1.066 mol/L，提取温度74.386 ℃，酸沉pH值2.572，料液比1∶1.441（V/V），在此条件下模型预测的产量为4.011 mg/mL。考虑到操作的可行性，将最优提取工艺修改为NaOH浓度为1 mol/L，提取温度为74 ℃，pH为2.5，料液比为1∶1.4（V/V）并进行验证性试验，在该条件下黑色素含量为3.982 mg/mL，与理论值相比，误差为0.72%。
3 结论
本试验在单因素的基础上，利用响应面法对碱法提取冠突散囊菌胞外黑色素的条件进行了优化，并建立了可靠的二次多项模型。通过方差分析表明，模型的拟合度较好，得到最优提取工艺为NaOH浓度为1 mol/L，提取温度为74 ℃，酸沉pH为2.5，料液比为1∶1.4（V/V）。采用该工艺进行验证，在最优提取条件下，冠突散囊菌胞外黑色素提取达到最大值3.982 mg/mL，与预测值基本吻合，说明试验得到的模型有效且可靠。
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