克氏原螯虾俗称小龙虾，是一种杂食性动物。自然环境中的一些水生植物、小型水生动物，甚至是同类都会成为小龙虾的食物[1]。克氏原螯虾肠道内存在着某些益生菌，可以分泌半纤维素酶来降解植物性食物中的半纤维素成分[2-3]，半纤维素中含有50%的木聚糖[4]。王振宇等[5-6]研究发现，牲畜饲料中木聚糖酶的添加有助于提高饲料的利用率。因此，从克氏原螯虾肠道内筛选高产木聚糖酶活力的菌株，并通过固态发酵优化菌株的产酶工艺条件，提高木聚糖酶产生菌的产酶活力，将会有益于小龙虾对饲料的充分利用。
目前，少量研究主要是对小龙虾致病菌的鉴定及致病机理的研究[7]。冯光志等[8-9]在2019年初对小龙虾肠道产木聚糖酶细菌的分离与鉴定进行了报道，而国内外对小龙虾肠道益生菌的相关研究鲜有报道。因此，本研究以前期从克氏原螯虾肠道内筛选的一株产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Z-3[8]为研究对象，木聚糖酶活力为响应值，利用响应面分析法对其固态发酵产酶条件进行优化，以期将其作为益生菌添加到克氏原螯虾饲料中，为克氏原螯虾的高产养殖提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Z-3：分离自小龙虾肠道，保存于武汉设计工程学院生物工程实验室[8-9]。
1.1.2 试剂
玉米芯、麸皮：武汉江夏农贸市场；酵母浸粉、蛋白胨、苯酚、无水三氯化铁、氯化铵、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dini trosalicylic，DNS）（生化试剂或分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氯化钠、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；木聚糖（分析纯）：上海金穗生物科技有限公司；D（+）木糖（生化试剂）：上海山浦化工有限公司。
1.1.3 培养基
斜面保藏培养基（LB固体培养基）：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂2 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然，121 ℃条件下灭菌20 min。
液体种子培养基：LB固体培养基中不添加琼脂。
固体发酵基础培养基[10-11]：麸皮15 g，NH4Cl 2 g，FeCl3 0.34 g，蒸馏水1 000 mL，搅拌均匀，pH自然，121 ℃条件下灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
722型分光光度计：天津瑞普斯仪器有限公司；TS-211B型恒温摇床：上海天呈实验仪器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱、BXM-30R型台式高速离心机：上海博远实业有限公司医疗设备厂；AL104型分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。
1.3 方法
1.3.1 木聚糖酶粗酶液的制备
称取1 g固态发酵基质，将其溶解在装有10倍体积蒸馏水的50 mL离心管中，在20 ℃条件下漩涡振荡溶解，用两层纱布过滤发酵基质，滤液于4 000 r/min条件下离心10 min，上清液即为木聚糖酶粗酶液[12]。
1.3.2 木糖标准曲线的制作[13]
取6支试管，依次加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL的木糖标准溶液，补加蒸馏水至0.5 mL，各管再加入1 mL质量浓度为1 mg/mL的木聚糖溶液，摇匀，37 ℃反应8 min后，各管加入3 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴5 min，取出加入5 mL蒸馏水，冷却后，摇匀，于波长540 nm处测定吸光度值。以木糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制木糖标准曲线（y=1.951 0x-0.030 1，R2=0.994 1）。
1.3.3 木聚糖酶酶活测定[14-15]
在一支试管中加入0.5 mL粗酶液，再取一支试管加入0.5 mL蒸馏水用作调零，分别加入1.0 mL木聚糖溶液，37 ℃保温5 min，加入3 mL DNS试剂沸水浴5 min后取出，迅速冷却至室温，补加蒸馏水5 mL，于540 nm处测定其吸光度值。
酶活力定义：在37 ℃条件下，1 mL酶液每分钟水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量为一个酶活单位，以U/mL表示。本研究中的酶活力单位选定为单位湿基培养基的酶活力，以U/g湿基表示。具体计算公式如下：
式中：E为样品的酶活力，U/mL；S为样品中葡萄糖质量，mg；N为粗酶液的稀释倍数；T为反应时间，min；V为参与反应的粗酶液体积，mL。
1.3.4 枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶固态发酵工艺优化单因素试验
取斜面保藏的枯草芽孢杆菌Z-3，按2.5%～3.0%（V/V）的接种量接入装有100 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min条件下过夜培养。按2%（V/V）的接种量将种子液接种于固态发酵培养基中，装料量为30 g/250 mL，37 ℃条件下培养7 d，每天取一次样，测定木聚糖酶活力，考察培养时间对Bacillus subtilis Z-3产木聚糖酶的影响。在此基础上，以麸皮与玉米芯混合物为碳源培养3 d，考察麸皮占比（20%、40%、60%、80%、100%）对Bacillus subtilis Z-3产木聚糖酶的影响[16-17]。随后，固定其他条件不变的情况下，依次考察添加量均为2.0 g/L氮源种类（氯化铵、硫酸铵、酵母提取物、蛋白胨）、培养基初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、培养温度（27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃）、装料量（20 g/250 mL、30 g/250 mL、40 g/250 mL、50 g/250 mL）、接种量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）对Bacillus subtilis Z-3产木聚糖酶的影响。
1.3.5 枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶固态发酵工艺优化响应面试验[18]
在单因素试验的基础上，选取影响显著的3个因素初始pH值（A）、麸皮占比（B）及培养时间（C）为考察因素，木聚糖酶活力（Y）为响应值，采用软件Design Expert8.0.6.1设计3因素3水平Box-Behnken试验，因素与水平见表1。
表1 枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶固态发酵工艺优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for solid-state fermentation technology optimization of xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
2 结果与分析
2.1 枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 培养时间对菌株Z-3产木聚糖酶的影响
培养时间对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响见图1。
图1 培养时间对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.1 Effect of culture time on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
由图1可知，随着发酵时间的延长，酶活力逐渐升高，并于发酵3 d时达到最高（2 330 U/g），随后呈下降趋势，分析原因可能是枯草芽孢杆菌Z-3的生长和木聚糖酶的产生属于同步偶联合成，随着发酵的进行，菌株的生长受到营养条件的限制和代谢产物的阻遏，导致发酵3 d后酶活力逐渐下降。因此，确定最佳培养时间为3 d。
2.1.2 碳源中麸皮占比对菌株产木聚糖酶的影响
根据前期试验结果，选用价格廉价、产酶能力强的麸皮与玉米芯混合物为碳源，固态发酵枯草芽孢杆菌Z-3，又根据麸皮在固态发酵过程中具有较好的松散透气特性，考察麸皮占比对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响，结果见图2。
图2 麸皮占比对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.2 Effect of bran ratio on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
由图2可知，随着麸皮占比的增加，木聚糖酶活力呈先增加后下降的趋势，当碳源中麸皮占比为60%时，酶活力最高，为2 882 U/g。因此，确定最佳麸皮占比为60%。
2.1.3 氮源种类对菌株产木聚糖酶的影响
氮源种类对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响见图3。
图3 氮源种类对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.3 Effect of nitrogen source types on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
由图3可知，不同氮源对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响不同。当以氯化铵为氮源时，木聚糖酶活力最高，为2 330 U/g；当以蛋白胨为氮源时，木聚糖酶活力最低，为1 170 U/g。结合工业经济考虑，氯化铵适合作为廉价易得的大规模氮源添加剂，因此，确定最优氮源为氯化铵。
2.1.4 初始pH值对菌株产木聚糖酶的影响
初始pH值对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响见图4。
图4 初始pH值对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.4 Effect of initial pH on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
由图4可知，随着初始pH值的升高，木聚糖酶活力呈现先升高后降低的趋势。当初始pH值为6.0时，木聚糖酶活力达到最高，为2 588 U/g。因此，确定最优初始pH值为6.0。
2.1.5 培养温度对菌株产木聚糖酶的影响
培养温度对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响见图5。
图5 培养温度对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.5 Effect of culture temperature on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
由图5可知，随着培养温度的升高，木聚糖酶活力呈现先升高后降低的趋势。当培养温度为37 ℃时，酶活力最高，为2 599 U/g。分析原因可能是枯草芽孢杆菌Z-3的最适宜发酵温度也为37 ℃，利于菌株产酶，这样也进一步验证了枯草芽孢杆菌Z-3的生长和木聚糖酶的产生属于同步偶联合成。因此，选择37 ℃作为最佳发酵温度。
2.1.6 装料量对菌株产木聚糖酶的影响
装料量对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响见图6。
由图6可知，随着装料量的增加，木聚糖酶活力呈先升高后下降的趋势，但装料量对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响不显著。当装料量为30 g/250 mL时，木聚糖酶活力最高，为2 658 U/g。分析原因可能与枯草芽孢杆菌Z-3的来源有关，其来源于小龙虾肠道，肠道微生物多为厌氧或兼性好氧微生物，它们的生长与氧的关系不是特别密切，而装料量正是侧面反映微生物对氧的需求程度。因此，确定最优装料量为30 g/250 mL。
图6 装料量对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.6 Effect of loading volume on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
2.1.7 接种量对菌株产木聚糖酶的影响
接种量对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响见图7。
图7 接种量对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响
Fig.7 Effect of inoculum on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
由图7可知，木聚糖酶活力随接种量的增高呈先升高后下降的趋势，但接种量对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的影响不显著。当接种量为2.5%时，木聚糖酶活力最高，为2 598 U/g。分析原因可能是接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成，而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。因此，确定最佳接种量为2.5%。
2.2 枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶工艺优化响应面试验
根据单因素试验结果，确定最优氮源为氯化铵，培养温度为37 ℃，装料量为30 g/250 mL，接种量为2.5%，选取影响显著的因素初始pH值（A）、麸皮占比（B）及培养时间（C）为考察因素，木聚糖酶活力（Y）为响应值，采用软件Design Expert 8.0.6.1设计3因素3水平Box-Behnken试验，结果与分析见表2，回归模型的方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnken试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用软件Design Expert 8.0.6.1对表2的结果进行多元二次回归拟合，得到以木聚糖酶活力（Y）为因变量，初始pH值（A）、麸皮占比（B）及培养时间（C）为自变量的二次多项回归方程：Y=389.60-18.73A+42.65B+43.88C-154.9A2-238.65B2-202.60C2。
由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型的拟合程度较良好。方程的决定系数R2=0.995 6，调整决定系数R2adj=0.990 0，说明该模型设计良好，试验误差小，在实验范围内能较准确的预测木聚糖酶的活力。方程的一次项A、B、C对结果影响显著（P＜0.05），二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。各因素间交互作用对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶影响的响应面及等高线见图8。
图8 各因素交互作用对枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶影响的响应面及等高线
Fig.8 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3
响应面图形分析可以直观地反映出各因素之间的交互作用对于响应值的影响[19]；等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。相应曲面的最高区域存在最大值[20]，即试验结果Y在试验区域内具有最大极值。由图8可知，三个交互影响的等高线图类似圆形，说明初始pH值和碳源中麸皮占比的交互作用、初始pH值和发酵时间的交互作用、碳源比例和发酵时间的交互作用对固态发酵产木聚糖酶的影响均不太显著。同时响应曲面光滑，均有最高点，说明均存在最大值。
2.3 验证试验及工艺条件的确定
利用软件Design Expert 8.0.6.1得到回归模型预测的枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的最优固态发酵工艺为麸皮占比61.43%，培养时间3.28 d，初始pH值为5.44，此时预测木聚糖酶酶活力为3 507.43 U/g湿基。为便于实际操作，将最优固态发酵工艺修正为麸皮占比60%，培养时间3 d，初始pH值为5.0。在此最优发酵工艺条件下，木聚糖酶酶活力实际值为3 459.58 U/g湿基。与预测值相比，相对偏差为1.36%，从而证实该模型可用于枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶固态发酵工艺优化。
3 结论
通过单因素试验和响应面试验优化得到克氏原螯虾肠道来源枯草芽孢杆菌Z-3产木聚糖酶的最优固态发酵工艺：培养时间3 d、培养温度37 ℃、初始pH值5.0、装料量30 g/250 mL，接种量2.5%，碳源为麸皮与玉米芯混合物，麸皮占比60%，氮源为氯化铵，在此最优发酵工艺条件下，木聚糖酶活力为3 459.58 U/g湿基，较初始发酵工艺下的木聚糖酶活力2 079.1 U/g湿基，提高了66.40%。
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