腌韭菜根是贵州黔东南的一款本土特色食品。近年来，随着贵州经济的发展，旅游业及我国大健康产业的快速兴起，腌韭菜根以其丰富的营养成分、独特的风味及保健功效，逐渐得到推广和人们的认可。黔东南腌韭菜根的工业化生产是将采集的原生态韭菜根（一种宽叶韭（Allium hookeri Thwaites）的肉质根）洗净晾干后拌以辅料（盐或糖分）腌制再真空包装后辐照灭菌或低温冷藏，食用时可根据当地少数民族人们的口味、喜好加辣椒、白酒、食盐、油等凉拌也可以当地腊肉炒之[1-3]。然而，韭菜根原料水分含量高又营养丰富，极易因滋生微生物而腐败，加之环境的影响或不规范的生产操作，袋装腌韭菜根在贮藏过程中会出现胀袋、变色、软化、酸败腐臭等现象，这不仅影响腌韭菜根产品的感官品质，也可能产生潜在的食品安全问题[4-6]。研究表明[7-9]，袋装食品的腐败很大程度上与其中的微生物生长代谢密切相关，食品腐败主要表现在某些微生物生长和代谢时生成有机酸、胺、硫化物、醇、醛、酮等，产生不良气味，使产品感官改变。不过，研究者也指出，微生物的生长受到如营养物质、温度、酸碱度、气体环境、NaCl等多种因素的影响，改变微生物的生长环境，可对其加以控制或利用[10]。因此，研究食品腐败微生物的生长特性，对指导食品防腐具有重要的意义。
本研究以从胀袋变质的腌韭菜根中分离出的5株腐败菌：巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、莴苣不动杆菌（Acinetobacfer lactucae）、解淀粉芽孢杆菌（Paenibacillus amylolyticus）、土杨芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）为供试菌株，探究其在不同温度、酸碱度、含氧量、防腐剂等因素下的生长状况，并确定这几种微生物耐受高温的温度与时间，为解决腌韭菜根腐败问题提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、莴苣不动杆菌（Acinetobacfer lactucae）、解淀粉芽孢杆菌（Paenibacillus amylolyticus）、土杨芽孢杆菌（Bacillus toyonensis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）：从胀袋韭菜根中分离筛选，并由凯里学院黔东南民族药综合利用工程技术研究中心微生物实验室分离鉴定；琼脂粉（生化试剂）、氯化钠（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；苯甲酸钠、乳酸链球菌素（食品级）：南通奥凯生物技术开发有限公司；蒸馏水：实验室自制，于121 ℃高压灭菌20 min可制得无菌水。
牛肉膏蛋白质液体培养基[11]：按《微生物学实验》中的配方配制，调节pH为7.2～7.5，在液体培养基配方中添加20 g/L的琼脂粉即得固体培养基，所有培养基均置于121 ℃高压灭菌20 min，备用。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2D型双人净化工作台：上海苏净实业有限公司；ZWY-CZ11D型恒温摇床培养振荡器：上海智诚分析仪器有限公司；SPX-150B-Z型生化培养箱、BGZ-246型电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；BIO-BRI型酶标仪：成都百乐科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌种的活化
取出保存于冰箱中的菌种，划线于牛肉膏蛋白胨平板培养基，并于（36±1）℃培养24 h，活化2次。挑取1环菌种加入已灭菌的100 mL牛肉膏蛋白胨的液体培养基中，于（36±1）℃摇床（转速180 r/min）培养24 h。
1.3.2 不同因素对5种腐败菌生长的影响
将制备好的各株菌的菌悬液接种于20 mL装有5 mL肉汤培养基（pH值为7.0）的试管中，使接种后的菌液浓度保持一致，于（36±1）℃摇床（转速180 r/min）培养24 h后测定菌液的OD600nm值[12]。为了探究各菌株在不同培养温度、pH值、装样量下的生长状况，在其他培养条件不变的情况下，分别改变单一培养条件，考察不同因素对5种腐败菌生长的影响。
温度：保持培养pH值、装样量不变，设置培养温度为4 ℃、15 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃，分别在不同温度下培养，平行实验3次。
pH值：保持装样量、培养温度不变，用1 mol/L氢氧化钠和1 mol/L盐酸调节营养肉汤培养基的pH值为4.5、5.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，平行实验3次。
装样量：保持培养pH值、培养温度不变，设置试管中肉汤培养基装样量为2 mL、4 mL、8 mL、10 mL、12 mL、14 mL，平行实验3次。
1.3.3 杀菌处理对菌株生长的影响
杀菌温度：在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃下分别处理20 min，平行实验3次。
杀菌时间：选用100 ℃，分别处理0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min；平行实验3次。
1.3.4 防腐剂对菌株生长的影响
选用苯甲酸钠、乳酸链球菌素两种防腐剂为研究对象，依据国家标准GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[13]设置添加浓度，各防腐剂的添加浓度见表1。将各防腐剂添加到肉汤培养基中，分别接种对数期生长的腐败菌，使其菌液初始浓度为500 CFU/mL，37 ℃下摇床培养12 h测定腐败菌的生长情况。另外，以不加防腐剂不接种的肉汤培养基为空白组，以不加防腐剂但接种的为对照组。
表1 单一防腐剂的添加质量浓度
Table 1 Mass concentration of single preservatives
1.3.5 数据处理及分析
腐败菌生长浓度的测定采用比浊法[14-15]，通过酶标仪测定菌液的OD600nm值即测定在波长600 nm处的样品吸光度值。利用Origin 8.0软件进行作图，使用SPSS 25软件分析及处理数据，显著性采用Duncan's多重比较法（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 培养温度对菌株生长的影响
温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一。当微生物处于最适生长温度时，生长代谢旺盛；而不适宜的温度则会导致微生物的代谢和形态改变或使微生物的蛋白质凝固变性而导致死亡[16]。不同细菌对培养温度的要求不一，大多数芽孢杆菌的抗热能力较强，其最适生长温度为30～37 ℃[17]。5种腐败菌菌株分别在4 ℃、15 ℃、25 ℃、37 ℃、45 ℃、50 ℃条件下培养24 h后，测定的菌液OD600nm值变化结果见表2。
由表2可知，在处理温度范围内，随着温度的升高，5株腐败菌的OD600nm值均呈先升高后下降的趋势，在37 ℃时生长最好，其OD600nm值分别为0.61、0.27、0.43、0.53、0.29，这说明5株腐败菌的最适生长温度为37 ℃；在15 ℃和50 ℃时，生长微弱；在4 ℃时，OD600nm值接近零，几乎不生长。
表2 培养温度对腐败菌生长的影响
Table 2 Effect of culture temperature on the growth of spoilage bacteria
注：不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
将4 ℃恒温培养箱下培养24 h的菌株继续培养至72 h，测定其OD600nm值，结果表明，5株腐败菌的OD600nm值在0.143 2～0.315 4之间。由此可见，在较长时间内，4 ℃低温对5株腐败菌具有较好的抑制作用。
2.2 pH对菌株生长的影响
细菌的生长需借助于细胞内的各种代谢活动来完成，这些代谢活动大多经不同酶催化的生化反应，反应需要在一定的pH条件下进行[16-17]。
5种腐败菌菌株分别在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0下培养24 h后的OD600nm值见表3。
表3 pH值对腐败菌生长的影响
Table 3 Effect of pH value on the growth of spoilage bacteria
由表3可知，在处理pH范围内，随pH升高，5株腐败菌的OD600nm值呈先升高后下降的趋势，巨大芽孢杆菌在pH为6.0时，生长最好，与其他pH处理比差异显著；土杨芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌在pH为6.5时，生长最好，与其他pH处理比差异显著；莴苣不动杆菌、解淀粉芽孢杆菌在pH为6.5时，生长最好，与pH=6.0处理比差异不显著，与其他pH处理比差异显著；pH在4.5以下或8.0以上时，生长会受到抑制。结果表明，5株腐败菌具有一定的耐酸性，最适生长pH值为6.0～6.5。本试验所用腌制韭菜根的pH值为6.28～6.44，十分有利于腐败微生物的繁殖生长，故生产中需要严格控制杀菌pH值，以更好地抑制腐败菌的生长。
2.3 装样量对菌株生长的影响
试管中的装样量反映了菌株生长的需氧量。装样量（培养液体积）越多，通氧量越少，菌株所获得的氧气量则越低[18]。腐败菌菌株在不同装样量（2～14）mL条件下培养24 h后，菌液的OD600nm值，结果见表4。
表4 装样量对腐败菌生长的影响
Table 4 Effect of volume of sample loading on the growth of spoilage bacteria
由表4可知，装样量为2～8 mL时，5株菌的OD600nm值变化较小，装样量为8～14 mL时，5株菌的OD600nm持续下降。根据细菌生长时对氧气的需求不同，可将其分为专性需氧菌、微需氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌4类[16-17]。综上分析，可判断该5种腐败菌均为兼性厌氧菌，即在有氧及氧气不足的条件下都能生长，有氧时生长更好。这正说明抽真空保存对抑制腐败微生物有一定辅助作用。
2.4 杀菌处理对菌株生长的影响
2.4.1 杀菌温度对菌株的影响
腐败菌菌株经不同高温处理20 min后，培养24 h的菌液OD600nm值，结果见表5。由表5可知，随着温度的上升，菌液OD600nm值降低，其中从90～120 ℃，OD600nm值急剧下降。当杀菌温度为100 ℃时，OD600nm值均很低，维持在0.056 7～0.148 3之间，说明此温度下可杀死大部分腐败菌，不过仍有少数菌株残留。当温度升至120 ℃时，OD600nm值接近于零，几乎全被灭活，由此可知，5株菌耐高温能力较强。但在实际生产过程中，杀菌温度过高会影响食品的品质，同时也增加生产成本。因此，可考虑适当降低温度，延长杀菌时间。
表5 杀菌温度对腐败菌生长的影响
Table 5 Effect of sterilization temperature on growth of the spoilage bacteria
2.4.2 不同杀菌时间对菌株的影响
在100 ℃下，经不同杀菌时间处理后，培养24 h的菌液OD600nm值，结果见表6。由表6可知，100 ℃杀菌处理必须超过20 min才具有良好的灭菌效果，不过即使杀菌时间达到35 min，也难以将腐败菌彻底灭活。综上分析，由于供试菌多为芽孢杆菌，耐热性较好，故在实际食品生产中，在确保口感、品质及生产成本的前提下，产品不宜采用高温杀菌，可考虑在较低温度下保藏或降低酸度或抽真空包装。
表6 100 ℃高温处理对腐败菌生长的影响
Table 6 Effect of 100 ℃high temperature treatment on the growth of spoilage bacteria
2.5 防腐剂对菌株生长的影响
2.5.1 苯甲酸钠的抑菌效果
防腐剂苯甲酸钠是酱腌菜中使用最多的防腐剂之一。不同质量浓度苯甲酸钠对5种腐败菌的抑制效果见表7。
由表7可知，当各腐败菌的初始浓度约为500 CFU/mL时，在苯甲酸钠质量浓度为0～0.2 g/kg内，随着浓度的增加，5株供试菌的OD600nm值明显下降，通过SPSS25.0中Duncan's多重比较法分析，发现各株腐败菌在苯甲酸钠质量浓度为0、0.1 g/kg和0.2 g/kg时的OD600nm值差异显著（P＜0.05）。继续升高浓度，各菌的OD600nm值下降缓慢，当苯甲酸钠质量浓度为0.2g/kg和0.3g/kg时，菌株Bacillustoyonensis与Acinetobacfer lactucae菌液的OD600nm值差异显著（P＜0.05），其他菌株不显著；当苯甲酸钠质量浓度为0.3 g/kg和0.4 g/kg时，Bacillus toyonensis与Acinetobacfer lactucae菌液的OD600nm值差异不显著（P＞0.05）。结果表明，添加单一苯甲酸钠的最佳质量浓度为0.2～0.3 g/kg。当苯甲酸钠浓度上升至0.5 g/kg时，Bacillus cereus、Acinetobacfer lactucae的OD600nm值趋近于0，Bacillus megaterium、Paenibacillus amylolyticus、Bacillus toyonensis的OD600nm值分别为0.080 8、0.090 5、0.142 8。表明苯甲酸钠（0～0.5 g/L）在一定程度上能有效抑制腐败细菌的生长。若考虑减少防腐剂用量，增强抑菌效果，后期可考虑与其他防腐剂复配使用[19-21]，复配苯甲酸钠的最佳添加质量浓度为0.1～0.3 g/kg。
表7 苯甲酸钠对腐败菌的抑菌效果
Table 7 Antibacterial effect of sodium benzoate on spoilage bacteria
2.5.2 Nisin的抑菌效果
生物防腐剂Nisin自1988年就被公认为一种安全的食品防腐剂，广泛应用于果蔬、肉制品、香肠和奶酪中，并在制药、化妆品和保健产品中也开始受到追捧。Nisin对革兰氏阳性（G+）细菌具有较好的抑制作用，特别是对食品中的一些产芽孢的细菌，如芽孢杆菌[22]。不同质量浓度的Nisin对初始浓度约为500 CFU/mL的5种腐败菌的抑制效果见表8。
由表8可知，Nisin对腐败细菌Acinetobacfer lactucae、Bacillus megaterium和Bacillus toyonensis的抑制效果显著，当Nisin的质量浓度为0.2 g/kg和0.3 g/kg时，Acinetobacfer lactucae、Bacillus megaterium和Bacillus toyonensis的OD600nm值趋近于0；Nisin对Bacillus megaterium和Paenibacillus amylolyticus的抑制效果较差，其OD600nm值最小为0.019和0.128。通过SPSS25中Duncan's多重比较法分析，当Nisin的质量浓度达0.20 g/kg后，菌株的OD600nm值之间差异不显著（P＞0.05）。综上分析，添加单一Nisin的最佳质量浓度为0.20 g/kg，且无论其是作为单一防腐添加剂还是考虑进一步与其他防腐剂复配都将是不错的选择。
表8 Nisin对腐败菌的抑菌效果
Table 8 Antibacterial effect of Nisin on spoilage bacteria
3 结论
腌韭菜根中的5株优势腐败细菌：Bacillus megaterium、Acinetobacfer lactucae、Paenibacillus amylolyticus、Bacillus toyonensis、Bacillus cereus具有较强的耐热性，其最适生长温度均为37 ℃，在15 ℃和50 ℃时生长微弱，4 ℃时几乎不生长。这些腐败菌具有较好的耐酸性，最适生长pH值为6.0～6.5，且均为兼性厌氧菌。高温杀菌时，需达100 ℃灭菌20 min以上才能达到较好的灭菌效果。单一防腐剂苯甲酸钠、Nisin对初始浓度约为500 CFU/mL的腐败菌具有良好的抑制效果，其添加的最佳质量浓度为0.2～0.3 g/kg。若考虑减少防腐剂的用量，增强抑菌效果，可考虑进一步进行防腐剂复配应用研究。
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