滇红茶（Dian black tea）是世界上消费最多的一种茶类[1]，滇红茶的品类较多，其中滇红茶是红茶中最具特色的滇红茶之一。滇红茶是通过萎凋、揉捏、发酵、干燥等加工工艺制作而成具有特色红汤和香甜味道的全发酵茶类[2]，富含多种微量元素、多酚类化合物和儿茶素[3-5]。这些物质的存在使滇红茶具有止渴消暑、提神消疲、生津清热、利尿、舒张血管、有益心脏健康等作用[6-7]。目前，各种发酵乳的研制主要集中在以牛乳作为主要原料或牛乳与水果等物质进行复配、工艺条件优化、发酵菌种等方面[8]，对主要原料的改进与创新方面的研究较少，其中以滇红茶为原料与牛乳结合的产品主要为奶茶系列，其口感、风味均较其他品种的奶茶风味更佳。但关于滇红茶与生牛乳混合后发酵制备发酵乳的研究鲜有报道。
随着发酵乳需求量的增加，人们对新产品、新品类的需求越来越高，利用滇红茶的特殊风味和发酵乳的有机结合可以开发一款具有一定特色的发酵乳产品，因此本试验以滇红茶粉和鲜牛乳作为原料经发酵制备出凝固型云南滇红茶发酵乳，通过单因素和响应面优化试验研究确定凝固型滇红茶发酵乳的加工工艺，并对产品的感官、理化、微生物指标进行测定，开发一款风味独特的滇红茶发酵乳，可扩大滇红茶的应用范围，同时对发酵乳新品种的开发具有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
滇红茶、蔗糖：市售；生鲜乳：云南省昆明市嵩明牧场；淡奶油：青岛雀巢有限公司；浓缩乳清蛋白粉WPC-5011；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：云南农业大学食品科技学院微生物实验室提供；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
HJJ-6水浴恒温电动搅拌器：常州华奥仪器制造有限公司；GMSX-280立式高压灭菌锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；GYB60-68高压均质机：上海东华高压均质机；SC-60商用发酵乳机控制器：广东冰天制冷设备有限公司；GZX-GF101-3-BS-2电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；HPX-9272ME恒温培养箱：上海博讯实业有限公司；NDJ-8S数显黏度计、AR224CN电子天平：奥豪斯仪器（常州）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
生鲜乳→验收与标准化→50～60 ℃预热→8～12 MPa均质→85 ℃、30 min杀菌→45 ℃以下冷却→调配→接种→40 ℃发酵→冷藏后熟→产品质量检测→凝固型酸奶
生鲜乳检测：测定原料乳pH6.85左右，过滤除去杂质，按照国家相关理化、卫生安全标准要求。
预热、均质：将生鲜乳预热至50～60 ℃，在8～12 MPa条件下均质10～15 min。
杀菌、冷却：将均质后的生鲜乳在（85±2）℃杀菌25～30 min，冷却至45 ℃以下。
调配：加入蔗糖、滇红茶粉、淡奶油搅拌均匀，至无凝乳状态。
接种、发酵：将杀菌后冷却的生鲜乳接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（质量比1∶2，添加量为0.01 g/kg牛奶）。
冷藏后熟：将发酵好的发酵乳在1～2 ℃储藏12 h以上。
1.3.2 单因素试验
取100 g生鲜乳，以牛奶质量为基准考察滇红茶粉添加量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、蔗糖添加量（7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%、10.0%）、发酵时间（6h、8h、10h、12h、14h）[9]，每组设置3个平行试验，对感官评分的影响，确定各原料的最适添加量。
1.3.3 响应面条件优化
在单因素试验的基础上，利用响应面中心复合设计试验（central composite design，CCD）以凝固型滇红茶发酵乳感官评分（Y1）为响应值，设置滇红茶粉添加量（X1）、蔗糖添加量（X2）、发酵时间（X3）3个因素为变量，进行3因素5水平的试验条件优化，明确滇红茶发酵乳的工艺参数[10-12]，响应面分析因素与水平见表1。
表1 滇红茶凝固型发酵乳发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Dian black tea set fermented milk
1.3.4 测定方法
感官评定：组织10位具有一定专业知识的人员经培训后组成评价小组，进行感官评价，依据色泽（20分）、气味（30分）、口味（30分）、组织形态（20 分）4个方面对调味型发酵乳进行评定，最后取算术平均值取平均值表示，满分100分[13-15]，发酵乳感官评分标准如表2所示。
表2 滇红茶凝固型发酵乳感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Dian black tea set fermented milk
脂肪：参照GB 5413.3—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》中的方法进行检测；非脂乳固体：参照GB 5413.39—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定》中的方法进行检测；蛋白质：参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的方法进行检测；酸度：参照GB 5413.34—2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度》的测定中的方法进行检测。黏度：发酵乳发酵结束并后熟24 h之后立即用黏度计在室温条件下，采用3号转子，固定转速12 r/min测定其黏度[16-17]。
酸度达到60°T所需时间：样品发酵后，测定其酸度，直至酸度达到（60±1）°T为止，记录其时间；其中酸度的测定根据国标GB/T 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》测定[18]。
持水力[19]：样品发酵结束后并后熟24 h之后，称取5 g样品，4 000 r/min离心10 min，静置10 min，除去透明液体，测残余物的质量，计算持水力，其计算公式如下：
式中：m代表残余物的质量，g；m0代表样品的质量，g。微生物指标：参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定乳酸菌数[20]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验优化
2.1.1 滇红茶粉添加量对凝固型滇红茶发酵乳感官评分影响
滇红茶具有特殊的香味，特别适合与牛奶搭配，产生特殊的奶茶香味，但发酵乳与奶茶最大的区别是滇红茶与牛奶联合发酵过程中可能会由于滇红茶中茶褐素的抑菌作用进而会影响到菌种的活力及发酵品质。但经预试验发现，滇红茶确实会影响牛奶的发酵速率，但影响的程度较小且产品的感官品质更佳。由图1可知，发酵乳的感官评分随着滇红茶粉添加量的增加呈现先升高后降低的趋势，添加量为0.2%时感官评分达到最大，为86.0分，品质最佳。当滇红茶粉添加量较低时色泽较差，没有滇红茶的特殊风味，而滇红茶粉添加量过多时，滇红茶当中的涩味较为明显，颜色较浅，入口的口感较差，且回味茶涩味较重，故选择凝固型发酵乳滇红茶粉添加量0.2%为宜。
图1 滇红茶粉添加量对发酵乳感官评分的影响
Fig.1 Effect of the Dian black tea powder addition on the sensory score of fermented milk
2.1.2 蔗糖糖添加量对凝固型滇红茶发酵乳感官评分影响
由图2可知，发酵乳的感官评分随蔗糖添加量的增加先升高后降低，添加量为9.0%时感官评分达到最大为89.0分。蔗糖添加量过小，奶中的甜味不能中和发酵乳中的发酵酸味，导致酸味过重；添加量过多，发酵乳口感太甜，发酵乳风味不够浓郁，影响口感。故选择凝固型滇红茶发酵乳蔗糖添加量9.0%为宜。
图2 蔗糖添加量对发酵乳感官评分的影响
Fig.2 Effect of sucrose addition on the sensory score of fermented milk
2.1.3 发酵时间对凝固型滇红茶发酵乳感官评分影响
由图3可知，随着发酵时间的延长，发酵乳的感官评分呈现先升高后降低的趋势，发酵时间在6 h，发酵乳已初步凝固，但形成的凝块质地太软，且未形成发酵乳独特的风味；发酵时间达到8 h后形成的凝块较高，但是感官品质还未达到最佳，发酵时间达到10 h后，发酵乳的凝固状态较好，评分为88分，且并未出现乳清析出的现象，因此确定凝固型滇红茶发酵乳的最佳发酵时间为10 h。
图3 发酵时间对发酵乳感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on sensory score of fermented milk
2.2 凝固型滇红茶发酵乳工艺配方优化响应面试验
2.2.1 响应面试验设计及结果分析
以单因素试验中获得的最适条件为基础，进行响应面试验优化，考察滇红茶粉添加量、蔗糖添加量、发酵时间3 个工艺参数对发酵乳发酵的影响，以感官评分（Y1）为评价指标，确定最佳的工艺配方，试验方案及结果见表3，回归模型方差分析见表4。
利用Design-expert 8.0.6中的Central Composite Design中心复合设计试验对表3进行结果分析，得到Y1/凝固型滇红茶发酵乳感官评分与滇红茶粉添加量（X1）、蔗糖添加量（X2）、发酵时间（X3）的二次方程模型为：Y1=81.11+0.69X1-0.14X2-0.024X3+0.74X1X2+0.83X1X3+0.13X2X3+0.073X12-0.71X22-0.078X3。
表3 滇红茶凝固型发酵乳发酵条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization of Dian black tea set fermented milk
表4 响应面试验回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model of response surface experiments
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响差异极显著（P＜0.01）。
由表4方差分析可知，凝固型滇红茶发酵乳感官评分回归模型显著性检验P=0.007 4＜0.05，模型极显著；凝固型滇红茶发酵乳感官评分回归模型失拟性检验P=0.682 8＞0.05，凝固型滇红茶发酵乳感官评分失拟项不显著；凝固型滇红茶发酵乳感官评分回归诊断决定系数为R2=0.853 9，表明预测效果较好，可用于预测凝固型滇红茶发酵乳感官评分受各因素的影响情况。凝固型滇红茶发酵乳感官评分拟合变异系数（coefficient of variance，CV）值分别为0.85%，表明试验误差小、可信度高，具有一定的实践指导意义。由表4可知，在所取因素水平范围内，各因素对凝固型滇红茶发酵乳感官评分影响的顺序分别为X1滇红茶粉添加量＞X2蔗糖添加量＞X3发酵时间。
2.2.2 影响因素交互作用
由表4可知，X1与X2、X1与X3之间交互作用显著（P＜0.05），对凝固型滇红茶发酵乳感官品质影响较大。由图4可知，凝固型滇红茶发酵乳感官评分随滇红茶粉的添加量和蔗糖添加量的增加而增加的趋势，在滇红茶粉的添加量和蔗糖添加量为0.3%及9.2%时，凝固型滇红茶发酵乳感官评分值最大，之后随着蔗糖添加量的增加，凝固型滇红茶发酵乳感官评分开始呈现下降趋势，与方差分析结果相符。凝固型滇红茶发酵乳感官评分随着滇红茶粉添加量以及发酵时间的增加呈现先略微下降而后慢慢增高的趋势，滇红茶粉添加量以及发酵时间为0.3%及11 h时，凝固型滇红茶发酵乳的感官评分值最大；交互作用显著与方差分析结果一致。
图4 滇红茶粉添加量与蔗糖添加量、滇红茶粉添加量与发酵时间交互作用对滇红茶凝固型发酵乳感官评分影响的响应曲面与等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between Dian black tea powder and sucrose addition,Dian black tea powder addition and fermentation time on the sensory score of Dian black tea set fermented milk
2.2.3 最佳条件的确定和回归模型的验证
本次试验中回归模型通过响应面法得到最优凝固型滇红茶发酵乳为滇红茶粉添加量0.3%，蔗糖添加量9.21%，发酵时间11.09 h，凝固型滇红茶发酵乳的感官评分理论值为82.45分。考虑实际操作情况与设备参数状况，调整凝固型滇红茶发酵乳工艺条件为滇红茶粉添加量0.3%，蔗糖添加量9.2%，发酵时间11 h，在上述最佳条件下进行验证试验，得到凝固型滇红茶发酵乳的感官评分实际值为（82.33±1.47）分，与理论值接近。
2.3 产品质量
2.3.1 凝固型滇红茶发酵乳感官指标
凝固型滇红茶发酵乳呈茶棕色、色泽均匀一致，黏附性较强，无乳清分离的现象，口感较为黏稠，入口后能够很好地呈现滇红茶风味。
2.3.2 理化指标和微生物指标
对普通发酵乳和滇红茶味发酵乳进行质量检验，相关理化和微生物指标结果如表5所示。
表5 滇红茶凝固型发酵乳理化指标和微生物指标检测结果
Table 5 Detection results of physicochemical indicators and microbial indicators of Dian black tea set fermented milk
注：肩标字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
由表5可知，凝固型滇红茶发酵乳的脂肪含量为（3.17±0.27）g/100g、非脂乳固体为（8.33±0.19）g/100 g、蛋白质为（3.22±0.14）g/100 g、pH为4.1±0.2、酸度91.3°T、持水力84.9%、黏度9 100 mPa·s，乳酸菌数达到1.0×107～1.0×108 CFU/mL，符合国家标准要求。
3 结论
本研究以滇红茶粉、生鲜牛乳为原料，接种乳酸菌发酵生产凝固型滇红茶发酵乳。在单因素试验结果的基础上，利用响应面中心复合设计试验，对凝固型滇红茶发酵乳的制作工艺条件进行优化。结果表明，凝固型滇红茶发酵乳的最佳工艺条件确定为滇红茶粉添加量0.3%，蔗糖添加量9.2%，发酵时间11 h。在此优化工艺条件下，所得凝固型滇红茶发酵乳感官评分为82.33分，质地均匀、酸甜适中、口感细腻、凝结状态良好，且有浓郁的乳香味和滇红茶独特的风味。脂肪含量为3.17 g/100 g，非脂乳固体为8.33 g/100 g，蛋白质为3.22 g/100 g，酸度为91.3 °T，pH值4.1，持水力为84.9%，黏度为9 100 mPa·s，微生物指标符合相关国标要求，为发酵乳品类的增加及滇红茶资源的开发利用提供参考。
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