苹果是我国具有明显国际竞争力的农产品之一，根据国家现代苹果产业技术体系抽样调查数据测算，2015至2020年期间，我国每年市场约有1 000万t以上的鲜果剩额，鲜果销售存在一定的问题[1-2]。由此可见，我国苹果产量大，苹果深加工产业有待发展。苹果酒是世界上仅次于葡萄酒的第二大发酵果酒，其含有丰富的维生素、氨基酸、矿物质及多酚等活性物质，具有软化血管、降血脂、降血压、调节新陈代谢、抗衰老和抗癌等作用，丰富的营养成分和较高的保健价值，使其受到广大消费者的喜爱[3-4]。
就目前苹果酒发酵技术的研究深度和发展程度而言，因苹果原料和发酵工艺等不同，直接导致了苹果酒品质的差异性。而目前单纯利用感官评定方法评价、鉴别苹果酒的品质往往不够客观，因此寻找一种快速、灵敏的检测方法尤为重要。风味特性是影响苹果酒品质的重要因素，分析苹果酒中的挥发性香气成分，可作为鉴别苹果酒品质的一种方法[5]。电子鼻和气相色谱-质谱技术（gas chromatog raphy mass spectrometry，GC-MS）是目前食品风味分析的重要研究手段[6]。电子鼻通过对产品风味轮廓信息进行综合分析，已经应用于白酒、葡萄酒、黄酒及啤酒的品牌区分[7-8]、风味分析[9-10]、香型分析[11-12]、产地辨别[13-14]、品种辨别[15]、酒龄辨别[16-18]、真伪鉴别[19]以及发酵过程中的动态监测[20]等方面。GC-MS技术能够实现待测样品具体风味化合物的定性、定量，检测灵敏度高、操作便捷、结果准确。而通过GC-MS和电子鼻与多变量数据分析区分鉴别不同品种苹果酒的研究鲜有报道。
因此，本实验分别以嘎啦、红星、瑞雪、瑞阳4种苹果为原料酿造苹果酒，采用电子鼻和固相微萃取-气相色谱-质谱（solidphase microextraction-gas chromatography-mass，SPMEGC-MS）技术相结合的方法检测其挥发性香气物质，通过主成分分析（principal component analysis，PCA）和线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）探索4种苹果酒香气特性的差异，并找出4种苹果酒的特征香气成分，旨在为苹果酒种类鉴别、品质研究以及瑞阳、瑞雪两个国审的苹果新品种的开发应用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
嘎啦、红星、瑞雪、瑞阳：陕西白水苹果试验站；安琪果酒专用酵母SY：市售；果胶酶Macerozyme R-10（酶活40 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司。
氯化钠（纯度≥99.5%）：四川西陇科学有限公司；2-辛醇（纯度≥98%）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HC-3018R高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；PEN3型便携式电子鼻：德国Airsense公司；GCMS-QP 2010 Ultra气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；手动固相微萃取（50/30 μm DVB/CAR/SPME）进样器：美国Supelco公司；DB-17MS毛细管柱（60 m×250 μm，0.25 μm）：美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 苹果酒酿造工艺流程及操作要点
操作要点：选择成熟度好，无腐烂变质的苹果，进行清洗、榨汁，将得到的苹果清汁倒入经SO2熏蒸过的发酵罐，并加入60 mg/L SO2。按50 mg/L的量添加果胶酶室温酶解12 h后，加入安琪果酒专用酵母SY于20 ℃条件下发酵7 d，所有苹果酒的发酵工艺相同。取发酵结束的新鲜酒样，离心冷冻置-20 ℃冰箱内待用。
1.3.2 电子鼻检测
表1为PEN3 型电子鼻10个金属氧化物传感器的敏感物质及其检测限。准确量取5 mL稀释了30倍的苹果酒酒样置于30 mL样品瓶中，加盖密封，室温富集5 min后进行测试。电子鼻参数设置：检测时间60 s，预进样5 s，清洗时间300 s，进样流量和载气流速均为300 mL/min[21]。
表1 PEN3电子鼻传感器阵列及其性能描述
Table 1 Sensor arrays and performance specification of electronic nose PEN3
1.3.3 SPME-GC-MS检测[22]
香气成分萃取：准确吸取各酒样5 mL至15 mL的固相微萃取专用萃取瓶中，添加6 μL质量浓度为0.45 mg/mL的2-辛醇作为内标，加入1.5 g NaCl后，密封后于40 ℃下平衡15min，插入已老化的萃取头萃取30 min。萃取完毕后，迅速取下萃取器，插入气相色谱仪进样口于260 ℃条件下解吸3 min。
GC-MS条件：程序升温至40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min速率升温至80 ℃，再按10 ℃/min升至250 ℃；进样口温度260 ℃，载气为氦气（He），流速1 mL/min；不分流进样。离子源温度为230 ℃，扫描范围是35～400 amu，电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV。
香气物质的定性定量方法：根据检测出的未知化合物经计算机检索与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）library、Wileylibrary相匹配，选择匹配度＞85%的物质作为有效香气成分，结合文献中的保留指数进行香气物质的定性；以2-辛醇为内标（质量浓度0.45 mg/mL），按内标法计算各成分质量浓度实现定量。
1.3.4 数据处理
采用SPSS 20.0统计软件进行显著性分析，电子鼻所测数据用其自带的Winmuster 软件进行主成分分析和线性判别分析。
2 结果与分析
2.1 电子鼻对不同苹果酒香气物质的分析
2.1.1 苹果酒香气物质电子鼻检测结合主成分分析
4种苹果酒挥发性成分PCA结果如图1所示，PCA分析结果中第一主成分（PC1）占比93.29%，第二主成分（PC2）占比6.21%，这两个主成分总贡献率占比99.5%，能充分的代表原始数据信息。说明PCA方法适用于不同品种苹果酒挥发性成分分析，且这两个主成分可以代表样品挥发性风味的主要特征。此外，每组样品的测定数据均能聚集成团，说明电子鼻数据稳定性、重复性较好。4种苹果酒样的香气成分无交叉区域，通过比较各组数据的横纵坐标发现红星酒和嘎啦酒的两个主成分差别不大，说明这两种酒的风味比较接近，而瑞雪酒、瑞阳酒的两个主成分差别较大，说明瑞雪酒、瑞阳酒的风味差异较大。
图1 不同苹果酒的主成分分析
Fig.1 Principal component analysis of different apple wines
2.1.2 苹果酒香气成分电子鼻检测结合线性判别分析
与PCA相比，LDA能通过扩大不同类别间数据点的距离、缩小同一类别数据点的距离，进一步分析电子鼻传感器响应值，获得更精确的分类[23]，从而更好地揭示样品间挥发性物质的差异情况[24]。由图2可以看出，LDA分析结果中第一主成分占比72.57%，第二主成分占比26.88%，这两个主成分总贡献率占比99.45%，很好的反映了样品的总体信息，且4种苹果酒样品簇间距较远，区别明显。从样品簇之间的分布距离来看，嘎啦酒和红星酒的距离较为接近，瑞雪酒和瑞阳酒的距离较大，说明嘎啦酒和红星酒的风味差异较小，瑞雪酒、瑞阳酒的风味差异较大。LDA与PCA方法的分析结果一致。
图2 不同苹果酒的线性判别分析
Fig.2 Linear discriminant analysis of different apple wines
2.2 SPME-GC-MS分析不同苹果酒的香气物质
电子鼻可以对苹果酒样品的整体风味进行分析，能直观地鉴别不同苹果酒的差异，但不能检测出苹果酒香气物质的具体种类和含量[25]。为进一步分析不同品种苹果酒的香气物质，采用SPME-GC-MS对4种苹果酒的挥发性香气成分进行检测，结果见表2。由表2可知，在嘎啦、红星、瑞雪、瑞阳4种苹果酒中共检测出76种挥发性物质，包括醇类11种、酯类43种、醛类7种、酮类3种、酸类7种、萜烯和其他类5种，其中酯类物质和醇类物质对苹果酒整体香气贡献较大，苹果酒是以酯香为主并富含醇香的果酒。如表3所示，不同苹果酒各类挥发性香气物质的数量及含量均存在较大差异，嘎啦、红星、瑞雪、瑞阳4种苹果酒的香气数量分别是66种、43种、45种、47种，总含量分别为7.17 mg/L、7.08 mg/L、6.64 mg/L和7.56 mg/L。
表2 不同苹果酒中挥发性香气成分测定结果
Table 2 Determination results of volatile aroma components in different apple wines
续表
续表
注：香气物质感觉阈值和香气描述参考文献[33-36]，下同。“n.d.”表示未检出。“-”表示未查阅到该物质的香气阈值或香气描述；同一行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
表3 不同苹果酒挥发性风味物质种类及含量
Table 3 Types and contents of volatile flavor substances in different apple wines
注：同一行不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.2.1 不同苹果酒中醇类香气物质比较
醇类是形成发酵酒风味的主要物质，多为氨基酸或糖类经酵母代谢产生[26]。本实验各酒样中含量相对较高醇类香气物质有异戊醇、苯乙醇、正己醇、正辛醇。不同品种苹果酒的醇类物质含量显著不同，且嘎啦酒醇类化合物质量浓度最高（2.12 mg/L），红星酒最低（1.96 mg/L）。4种酒中共检测出11种醇类物质，共有的有6种，分别是正丁醇、异戊醇、2,3-丁二醇、正己醇、正辛醇和苯乙醇。异丁醇和正戊醇分别只在嘎啦酒和瑞阳酒中检出，说明这两种酒更具醇香。异戊醇是4种苹果酒中含量最高的醇类物质，它是杂醇油的主要成分，赋予苹果酒白兰地香气和辛辣味[27]。苯乙醇是莽草酸类衍生物，具有一定的杀菌作用和诱人的玫瑰香味[28]。正己醇和正辛醇分别表现出青草味和玫瑰花香、甜草药味[29]。
2.2.2 不同苹果酒中酯类香气物质比较
酯类物质是苹果酒中最重要的香气成分，主要来源于果实和酒精发酵，富含花香、果香和酒香[30]。嘎啦、红星、瑞雪、瑞阳4种苹果酒中共检测出43种酯，分别检测出39种、28种、24种、25种，共有成分有18种，其中辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯的含量较高，赋予了苹果酒水果香、花香、青苹果香、香蕉味。在本研究中，瑞阳酒酯类物质含量（5.05 mg/L）显著高于红星酒（4.88 mg/L）、嘎啦酒（4.48 mg/L）和瑞雪酒（4.40 mg/L）中的（P＜0.05），且瑞阳酒中的辛酸乙酯含量也显著高于其他三种酒的（P＜0.05），具有更浓郁的果香和花香。
2.2.3 不同苹果酒中醛、酮、酸类香气物质比较
醛酮类物质主要来源于发酵过程中的各类代谢途径，如糖、氨基酸和脂肪酸代谢等，能够增加果酒的水果香[31]。4种苹果酒中共有的醛类物质有乙醛、异戊醛和正己醛，赋予了苹果酒果香、苹果香、清香和草香。苯乙醛和壬醛仅在嘎啦酒中检测出，表明嘎啦酒具有更浓郁的甜芳香味、花香和柑橘味。此外，检测出3种酮类物质，分别为1-庚酮、2-辛酮和2-壬酮，三种物质在瑞雪酒和瑞阳酒均有检出，嘎啦酒中检测出了2-庚酮和2-壬酮，红星酒中仅检测出了2-辛酮。
在酒中，酸类物质主要来源于酒精发酵，其含量受发酵条件、营养物质含量和酵母类型影响，酸类物质浓度较低时呈奶酪香，较高时则会产生腐臭味，其可与醇类物质反应生成酯，提高酒体的协调性和平衡性[31-32]。4种苹果酒中共检测出7种酸，其中具有愉快脂肪气味的癸酸在4种酒中均有检出；瑞雪酒中癸酸含量最高，为272.98 μg/L，红星酒中癸酸含量最低，为107.75 μg/L。
2.2.4 不同苹果酒中萜烯及其他物质比较
萜烯类物质是植物次生代谢产物，多与花香及柠檬香有关，其香气阈值较低，即使在浓度较低时对酒体香气风格也有较大贡献[33]。本实验共检测出1,3,5,7-环辛四烯、d-柠檬烯和香茅醇3种萜烯类物质，其中1,3,5,7-环辛四烯仅在瑞雪酒中检出，含量为4.97 μg/L，d-柠檬烯仅在嘎啦酒中检出，含量为11.64 μg/L。4种酒中均检测出香茅醇，含量在12～15 μg/L之间，香茅醇具有柠檬味、青草味、丁香花香和蔷薇香。其他类化合物尽管种类和含量较少，但也有一定的贡献作用，本实验在嘎啦酒中检测出了异丁香酚、2,4-二叔丁基苯酚，能够赋予嘎啦酒丁香味和果香味。
2.3 不同苹果酒特征香气物质的分析
利用已报道的感觉阈值及香气描述相关文献计算香气物质的香气值[21，34-36]，据此确定样品的特征香气成分。香气值（odor activity value，OAV）是香气物质浓度与其香气阈值之比。香气值≥1的香气物质可被认定为特征香气成分，香气值越大，对整体香气的贡献也就越大；但香气值＜1的物质也不容忽略，其同样能够增加酒体的香气及协调性。如表4所示，本实验共得到13种特征香气物质，嘎啦、红星、瑞雪、瑞阳酒分别有11种、8种、7种、7种。4种苹果酒共有的特征香气物质有6种，包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯。李记明等[37]研究发现，丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯及癸酸乙酯是苹果酒区别于其他酒的特征香味成分，与本实验研究结果一致。庚酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、壬醛仅在嘎啦酒中的OAV值＞1，说明这三种物质是嘎啦酒区别于其他三种酒的特征香气物质。乙酸己酯仅在红星酒中OAV值＞1，说明红星酒和其他三种酒相比具有更浓郁的果香。辛酸-3-甲基丁酯仅在瑞阳酒中OAV值＞1，说明瑞阳酒和其他三种酒相比其具有浓郁的梨香。
表4 不同苹果酒特征香气成分的香气值
Table 4 Odor activity value of characteristic aroma of different apple wines
注：“-”表示未检出该物质。
3 结论
苹果酒含有丰富的香气物质，且不同品种的苹果酒香气特性差异较大。电子鼻技术结合PCA和LDA方法，能够很好地区分陕西白水嘎啦、红星、瑞雪和瑞阳4个品种的苹果酒。采用SPME-GC-MS对4种苹果酒中的挥发性香气物质进行分析检测，共检测出76种挥发性香气物质，包括醇类11种、酯类43种、醛类7种、酮类3种、酸类7种、萜烯和其他5种，香气物质总量从高到低依次为瑞阳酒、嘎啦酒、红星酒和瑞雪酒。通过计算香气值得出丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯为4种苹果酒共有的特征香气物质。通过电子鼻和气相色谱-质谱两种技术的结合，从宏观和微观上研究苹果酒的香气物质，可为不同苹果酒的快速鉴别、酿造原料的选择及香气特性的综合评价提供参考。
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