近年来，鱼鳞胶原蛋白肽广泛应用于食品、化妆品、医药等行业[1-3]，但是鱼鳞胶原蛋白肽的鱼腥味严重影响了其在食品和化妆品中的应用。据报道，该腥味物质成分主要为氧化三甲胺（trimethylamine N-oxide，TMAO）[4-6]，去腥主要手段有去除或掩盖氧化三甲胺。目前水产品的生产中常用的去腥方法主要为基于吸附或包埋等机理的有活性炭吸附法、大孔树脂吸附法、β-环糊精包埋法、抗氧化剂去腥法等方法[7-11]。而微生物发酵去腥是通过微生物的新陈代谢作用使小分子的腥味物质转化为无腥味的大分子物质，或者在微生物酶的作用下发生分子结构的修饰转化为无腥味物质[12]。姚艳艳等[13-14]分别用植物乳杆菌对海带和草鱼进行了去腥研究；马丽杰等[15-17]分别用酵母对鱼下脚料、鲤鱼和草鱼进行了去腥研究，去腥效果优于传统方法。本试验采用微生物制剂对鱼鳞胶原蛋白肽进行去腥，旨在提高去腥效果的同时减少蛋白损失率。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白鲢鱼鱼鳞：武汉梁子湖水产品加工有限公司；甜酒曲、酿酒酵母（食品级）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌（食品级）：北京川秀科技有限公司；氧化三甲胺标准品（＞99%）：东京化成工业株式会社；碱性蛋白酶（纯度酶活20万U/g）：丹麦诺维信公司；雷士盐（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；硼酸、氢氧化钠、浓硫酸、甲基红、溴甲酚绿、硫酸钾、硫酸铜、无水乙醚、无水乙醇、丙酮、浓盐酸（均为分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-2000型紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）有限公司；FA2004B型电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；JJ-1型数显精密电动搅拌器：上海精宏试验设备有限公司；TS型恒温培养振荡器：上海世平试验设备有限公司；KDN型消化炉：上海精隆科技有限公司；K9840型自动定氮仪：山东海能科学仪器有限公司；FE20K型精密酸度计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程及操作要点
鱼鳞脱水→粉碎→预处理→酶解→灭酶→离心→鱼鳞酶解液→去腥→过滤→检测
（1）预处理：对鱼鳞进行脱脂、脱钙处理，脱脂条件为44 ℃、0.8 mol/L NaHCO3溶液、固液比1∶25（g∶mL）、浸泡8 h。脱钙条件为34℃、1.0mol/L醋酸、固液比1∶20（g∶mL）、浸泡8 h。
（2）酶解：用碱性蛋白酶酶解鱼鳞制备胶原蛋白肽，酶解条件为55 ℃、pH为7、底物浓度为1.2 g/100 mL、加酶量为0.012 g/100 mL、酶解5 h。
（3）去腥：采用微生物液态发酵法去腥，考察适宜的微生物去腥剂和去腥条件。
（4）检测：通过检测去腥前后氧化三甲胺含量以及蛋白质含量，计算氧化三甲胺去除率和蛋白质损失率两个指标来衡量去腥效果。
1.3.2 去腥微生物的选择
取50 mL酶解液3份，分别添加0.01%的甜酒曲、乳酸菌和酿酒酵母。在28 ℃、初始pH值为4.0条件下水浴振荡2 h，过滤。比较氧化三甲胺去除率及蛋白损失率以确定去腥微生物制剂的选择。
1.3.3 去腥条件优化
利用1.3.2中去腥效果最好的微生物对酶解液进行去腥，分别取50 mL酶解液于水浴振荡器中进行微生物接种量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）、去腥时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min）、去腥初始pH（3.5、3.8、4.0、4.3、4.7、5.0）和去腥温度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃、42 ℃）的单因素试验。在单因素试验的基础上，利用4因素3水平L9（34）双指标正交试验优化去腥工艺条件。正交试验因素与水平见表1。
表1 鱼鳞胶原蛋白肽腥味脱除工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for deodorization process optimization of fish scale collagen peptide
1.3.4 测定方法
取5 mL过滤后的样品，检测蛋白质含量，取10 mL过滤后的样品检测氧化三甲胺含量，分别计算蛋白损失率和氧化三甲胺去除率。氧化三甲胺的检测参考黄国霞等[19-20]的雷士盐分光光度法进行测定；蛋白质含量的检测采用凯氏定氮法。
氧化三甲胺去除率的计算公式如下：
式中：Y1为氧化三甲胺去除率；X为去腥后酶解液中氧化三甲胺的含量，mg/mL；X1为原始酶解液中氧化三甲胺的含量，mg/mL。
蛋白质损失率的计算公式如下：
式中：Y3为蛋白质损失率；z为酶解液中总氮含量，g/100 g；z1为去腥后酶解液中总氮含量，g/100 g。
2 结果与分析
2.1 去腥微生物的确定
图1 不同微生物的去腥效果比较
Fig.1 Comparison of deodorization effect of different microorganisms
由图1可知，甜酒曲、乳酸菌和酿酒酵母三种微生物对氧化三甲胺去除率差别不大，分别为47.24%、48.33%和42.22%；但是对鱼鳞胶原蛋白肽的蛋白损失率影响较大，其中甜酒曲去腥时的蛋白损失率远远小于其他两种微生物，只有（21.43±1.86）%。原因可能是这3种微生物都能利用氧化三甲胺或代谢出酒精、醋酸、乳酸等去腥物质，但是由于甜酒曲的粒径较乳酸菌和酿酒酵母大，比表面积小，同时产生的吸附作用较小，进而使得蛋白损失率相对较小。综合考虑氧化三甲胺的去除率和蛋白损失率，选择甜酒曲作为鱼鳞胶原蛋白肽的去腥微生物较好。
2.2 甜酒曲对鱼鳞酶解液去腥工艺优化结果
2.2.1 甜酒曲接种量对去腥效果的影响
图2 甜酒曲接种量对去腥效果的影响
Fig.2 Effect of sweet Jiuqu inoculum on deodorization
由图2可知，随着甜酒曲接种量的增加，氧化三甲胺的去除率也不断增加。甜酒曲接种量为0.08%时，氧化三甲胺去除率较高为（89.93±0.34）%，蛋白损失率相对较小为（19.43±1.9）%。当添加量＞0.08%时，氧化三甲胺去除率增加缓慢；同时，蛋白损失率也逐渐增大。原因可能是甜酒曲代谢协同吸附作用，接种量越大，利用的氧化三甲胺越多，使得三甲胺去除率越大；同时，吸附面积也越大，吸附能力也越强，导致蛋白损失率越大[21]。考虑去腥效果兼顾蛋白损失率，选择合适的甜酒曲接种量为0.08%。
2.2.2 去腥时间对去腥效果的的影响
图3 去腥时间对去腥效果的影响
Fig.3 Effect of deodorization time on deodorization
由图3可知，随着甜酒曲去腥时间的增加，氧化三甲胺的去除率先快速增加，到脱腥时间达到30 min后时，变化不大；同时，蛋白损失率也逐渐增大。原因可能是，鱼鳞胶原蛋白肽酶解液中的氧化三甲胺（1.39 mg/mL）比蛋白质（2.05 g/100 g）少的多，此时液态发酵的速度远大于吸附速率，故氧化三甲胺的去除率很快趋于稳定，而蛋白损失率却还在继续增加。考虑去腥效果兼顾蛋白损失率，选择合适的甜酒曲去腥时间为30 min。
2.2.3 去腥初始pH对去腥效果的影响
图4 去腥初始pH值对去腥效果的影响
Fig.4 Effect of deodorization initial pH on deodorization
实验用甜酒曲主要菌种为根霉菌，其适宜的pH范围为3.5～5.0。由图4可知，在试验范围内，随着去腥初始pH的增加，氧化三甲胺去除率先减小后増大，但总体变化不大，均＞86%；而蛋白损失率却一直有所增加，当pH值增加至4.7后，蛋白损失率急剧增加到（25.56±2.1）%。原因可能是，试验pH值均在甜酒曲的最适pH范围内，所以氧化三甲胺去除率影响不大；而由于鱼胶原蛋白的等电点为4.7～5.0，故当pH到达4.7后，部分蛋白质变性，会造成蛋白质损失率迅速增加。因此，选择适宜的去腥初始pH为3.5。
2.2.4 去腥温度对去腥效果的影响
图5 去腥温度对去腥效果影响
Fig.5 Effect of deodorization temperature on deodorization
由图5可知，随着去腥温度的升高，氧化三甲胺去除率先增大后减小，当温度为32 ℃时，氧化三甲胺去除率达到最大，高达（93.1±0.54）%；同时，蛋白损失率一直随温度增加而增加。原因可能是，32 ℃时甜酒曲中微生物的代谢能力最强；而根据吸附动力学原理，温度不太高时，随着温度的增加，吸附能力增强。综合考虑氧化三甲胺去除率和蛋白损失率选择适宜的去腥温度为32 ℃。
2.2.5 甜酒曲发酵去腥双指标正交试验结果
表2 鱼鳞胶原蛋白肽腥味脱除工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for deodorization process optimization of fish scale collagen peptide
续表
通过表2知，以氧化三甲胺为评价指标分析，影响甜酒曲发酵去腥效果的主次因素为甜酒曲接种量（A）＞去腥初始pH（C）＞去腥温度（D）＞去腥时间（B），发酵去腥的最佳工艺条件组合为A1B3C3D1，即甜酒曲接种量为0.06%、去腥时间为40min、去腥初始pH为4.0、去腥温度为28℃。以蛋白质损失率为评价指标分析，影响甜酒曲发酵脱腥效果的主次因素为去腥时间（B）＞甜酒曲接种量（A）=去腥初始pH（C）＞去腥温度（D），发酵去腥的最佳工艺条件组合为A2B3C3D1。即甜酒曲接种量为0.08%、去腥时间为40 min、去腥初始pH为4.0、去腥温度为28 ℃。
根据综合平衡原则：若某指标为主要影响因素，取其作为主因素时的优水平，应优先满足相对重要的指标的因素优水平的选取，对于影响不显著的因素，其水平的选取则应考虑成本。本试验重点考察三甲胺去除率，故甜酒曲发酵去腥最佳工艺条件组合为A1B3C3D1，即甜酒曲接种量为0.06%，去腥时间40 min，去腥初始pH为4.0，去腥温度为28 ℃。
由验证试验可知，甜酒曲发酵法处理鱼鳞胶原蛋白去腥工艺条件A1B3C3D1下氧化三甲胺去除率为（95.85±0.26）%，高于正交试验中的任何一组，蛋白损失率为（5.95±2.86）%，仅低于6号试验，但6号试验的三甲胺去除率太低只有（87.61±0.35）%，故该去腥工艺的最优条件为A1B3C3D1。
3 结论
本研究对比分析了几种微生物对鱼鳞胶原蛋白肽脱腥的效果，优选出最佳去腥微生物制剂为甜酒曲；进而通过单因素试验和双指标正交试验优化出甜酒曲发酵去腥的最佳工艺条件：甜酒曲接种量为0.06%、去腥时间40 min、去腥初始pH为4.0、去腥温度为28 ℃。在此优化条件下，氧化三甲胺去除率可达（95.85±0.26）%，蛋白质损失率为（5.95±2.86）%。优于传统的活性炭吸附法对鱼鳞胶原蛋白肽的去腥结果，氧化三甲胺去除率（89.81±0.40）%，蛋白损失率（11.77±1.44）%。实现了本次研究的目的，在腥味物质去除率最高的主要条件下，尽可能减少蛋白质损失率。
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