葛根（Puerarin）属豆科植物野葛的块根，是国家卫生部认定的兼具药用与食用的植物[1]，主要成分为淀粉，含有必需氨基酸和微量元素，还含有葛根素、异黄酮和大豆苷元等多种益生元素，可改善心血管循环，降低血糖和增强机体免疫力等[2-6]，因而各种葛根功能产品（葛根面条、葛根蛋糕、葛根豆腐、葛根口服液和葛根酸奶）应运而生[7]。酸奶营养丰富，益生菌含量多，易被人体吸收，能有效调节人体肠道微生物菌群[8-10]。单纯的原味酸奶具有口感单一和益生功能少等特点，因而添加了粮食和果蔬等含糖量低、脂肪含量低、热量低的多口感多益生功能型酸奶必将成为国内外酸奶市场消费的主导[11-13]。在葛根酸奶制作方面，张雁等[14]制作葛根酸奶采用新鲜葛根为材料，经一系列操作后过滤得葛根汁，不仅操作繁琐，过滤过程中也会导致葛根营养物质流失，利用率降低；冷桂华等[15]制作葛根酸奶时除了护色剂以及稳定剂外，还用多种酶对新鲜葛根进行处理，不仅操作过程繁琐，还添加了过多的物质，本实验采用葛根粉为原料，在制作过程中直接加入，不需要过多步骤，简单易操作。
本实验以易获得的葛根粉作为原材料，通过单因素试验及响应面法探索葛根酸奶的制作工艺，并检测其理化和微生物指标以及抗氧化性。旨在为葛根酸奶的市场化供应提供科学的理论依据，并且为家庭自制葛根酸奶提供科学的参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葛根粉：购于江西抚州农家；德运全脂奶粉和白砂糖：市售；川秀乳酸菌酸奶发酵粉（保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）∶嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）（1∶1）：市售。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美国Sigma公司；邻苯二甲酸氢钾、氢氧化钠、30%过氧化氢、七水合硫酸亚铁、无水乙醇、水杨酸（均为分析纯）：南宁西陇化工有限公司。
MRS肉汤培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂培养基、煌绿乳糖胆盐培养基：北京奥博星制造生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
SPX-250B-Z型生化培养箱、HHS-21-4W型电热恒温水浴锅、YXQ-LS-18SI型手提式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-2FD型洁净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SQP型电子分析天平：赛多利斯科学有限公司；BCD-402WDBA型海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；V-1800型可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；WYT糖度计：成都豪创光电仪器有限公司；LL550型离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葛根酸奶制作工艺流程及操作要点
操作要点：葛根粉加少量冷水溶解，加入热水，煮沸至透明成糊状；全脂奶粉与白砂糖加少量温水溶解后，加入葛根液后充分搅拌；将葛根奶液于100 ℃杀菌并均质8 min，冷却至室温，得无菌葛根奶液；菌粉用少量无菌水溶解，待葛根奶液冷却后加入；将接种后的无菌葛根奶液置于恒温培养箱中培养4～6 h至完全凝固，于4 ℃冰箱冷藏24 h进行后熟得到葛根酸奶。
1.3.2 单因素试验设计
单因素设置5个变量：奶粉添加量4%、6%、8%、10%、12%、白砂糖添加量4%、6%、8%、10%、12%、葛根粉添加量1%、2%、3%、4%、5%、发酵温度40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、发酵时间3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，以感官评分为评价指标，选出最优的工艺参数。
1.3.3 响应面优化试验设计
根据单因素试验结果，通过Plackett-Burman（PB）试验和最陡爬坡试验确定葛根粉添加量、全脂奶粉添加量和发酵时间3个较为重要的影响因子为试验因素，利用Design-ExpertV.10对响应面试验进行设计。葛根酸奶感官评分为响应值进行响应面分析，得到葛根酸奶3个显著因素交互作用的等高线图和响应面，并根据对等高线及响应面的分析进行试验优化。Box-Behnken试验设计因素与水平如表1所示。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design
1.3.4 酸奶品质分析
（1）感官评定
随机选取10位同学组成评价小组对葛根酸奶进行感官评分，参照GB/T 19302—2016《食品安全国家标准发酵乳》[16]，从组织形态、口感、风味对葛根酸奶进行评分，满分100分。以感官评分平均值为评价指标，评分标准如表2所示。
表2 葛根酸奶感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of Pueraria yogurt
（2）理化指标及微生物指标检测
酸度：按照GB 5413.34—2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》[17]中的方法测定。
糖度：酸奶于离心机4 500 r/min离心10 min，取上清液，并用糖度计测量自制葛根酸奶与市售酸奶的糖度。
乳酸菌数：按照GB/T 4789.35—2016《食品安全国家标准乳酸菌检验》[18]中的方法测定。
大肠杆菌：按照GB/T 4789.3—2008《食品卫生生物学检验大肠杆菌计数》[19]中的方法测定。
1.3.5 酸奶抗氧化性测定
（1）DPPH自由基清除率测定
酸奶于离心机4 500 r/min离心10 min，取上清液备用。参考张玉坤[20]的方法测定葛根酸奶对DPPH自由基的抗氧化性，以维生素C（vitamin C，VC）作为阳性对照。
（2）羟自由基清除率测定
酸奶于离心机4 500 r/min离心10 min，取上清液备用。参考王临宾[21]的方法测定葛根酸奶对羟自由基的抗氧化性，以2 mg/L的VC作为阳性对照。
1.3.6 数据处理
采用Excel 2010进行单因素试验的绘图；运用Design-Expert 10.0.3进行PB试验、响应面试验设计、结果和分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 葛根粉添加量的确定
葛根粉添加量对酸奶品质的影响见图1。由图1可知，葛根酸奶感官评分随葛根粉的添加量在1%～5%范围内的增加先上升后下降，原味酸奶风味偏淡，葛根粉添加量1%时葛根味道不明显；添加4%时葛根独特香味、凝乳好、具浓郁的酸奶风味，葛根粉添加量5%时酸奶较粗糙，过于黏稠。因此，添加4%的葛根粉时评分最佳。
图1 葛根粉添加量对酸奶感官品质的影响
Fig.1 Effect of Pueraria powder addition on yogurt sensory quality
2.1.2 奶粉添加量的确定
奶粉添加量对酸奶品质的影响见图2，由图2可知，葛根酸奶感官评分随奶粉添加量在4%～12%范围内的增加先上升后下降，奶粉添加量＜8%时，酸奶风味不浓郁，凝乳不均匀；奶粉添加量为8%时，酸奶味浓郁，具有葛根清香，粘稠适中，凝乳均匀，口感细腻，感官评分为86；奶粉添加量＞8%时，酸奶过于黏稠，口感粗糙。因此，添加8%奶粉时感官最佳。
图2 奶粉添加量对酸奶感官品质的影响
Fig.2 Effect of milk powder addition on yogurt sensory quality
2.1.3 白砂糖添加量的确定
图3 白砂糖添加量对酸奶感官品质的影响
Fig.3 Effect of sugar addition on yogurt sensory quality
白砂糖添加量对酸奶品质的影响见图3。由图3可知，葛根酸奶感官评分随白砂糖添加量在4%～12%范围内的增加先上升后下降。葛根粉添加量为6%时，酸奶黏稠度恰好，酸奶味浓郁且具有葛根清香，酸甜度适中；添加量低于6%，酸奶味道不浓郁，甜味不明显；添加量增至8%时，酸奶过甜，稠厚感差。因此，6%的白砂糖添加量最为合适。
2.1.4 发酵温度的确定
发酵温度对酸奶品质的影响见图4。由图4可知，葛根酸奶感官评分随发酵温度的增加先升高后降低。高于42 ℃时，酸奶口感润滑度下降，部分产生少量乳清；温度为42 ℃时，酸奶口感最佳；低于42 ℃时，葛根酸奶，凝乳不均匀，酸奶风味不浓郁。因此，最佳发酵温度为42 ℃。
图4 发酵温度对酸奶感官品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on yogurt sensory quality
2.1.5 发酵时间的确定
发酵时间对酸奶品质的影响结果见图5。由图5可知，葛根酸奶感官评分随发酵时间的增加先上升后下降，高于5 h时，酸奶过于黏稠，部分产生少量乳清；时间为5 h时，酸奶口感细腻，酸甜适中；发酵时间低于5 h时，酸奶过稀。因此，最佳发酵时间为5 h。
图5 发酵时间对酸奶感官品质的影响
Fig.5 Effect of fermentation time on yogurt sensory quality
2.2 Plackett-Burman试验设计
Plackett-Burman试验是指在较少的试验次数下，从多因素试验中筛选出影响比较显著的因素[22]。表3为PB试验设计以及感官评分结果，以感官评分（Y）为响应值得出的响应面结果如表4。对表4进行分析可以得出，模型P=0.039 3＜0.05，具显著性，说明模型在统计学上有意义。5个因素中，对葛根酸奶品质的影响为奶粉添加量＞发酵时间＞葛根粉添加量＞发酵温度＞白砂糖添加量。由系数估值可知，A、C、D、E为正效应，B为负效应。结合各因素P值以及正负效应，选择葛根粉添加量、奶粉添加量和发酵时间这3个显著性较强的因子进行最陡爬坡试验。
表3 Plackett-Burman试验设计
Table 3 Design of Plackett-Burman tests
表4 Plackett-Burman试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of Plackett-Burman tests
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）。
2.3 最陡爬坡试验
表5 最陡爬坡试验结果
Table 5 Results of the steepest climbing tests
由各因素的P值可得影响较大的因素为：奶粉添加量、发酵时间和葛根粉添加量；正负效应影响爬坡的方向和步长；由系数估值可得，葛根粉添加量和发酵时间为正效应，奶粉添加量为负效应。设置五个试验进行感官评分。由表5可知，感官评分最高的是试验号1，为88分。所以以葛根粉添加量4%、奶粉添加量8%、发酵时间5 h为最佳结果作为Box-Behnken试验设计的中心点展开试验。
2.4 响应面优化试验
在PB试验和最陡爬坡试验的基础上，响应面试验选取的三个因素为：葛根添加量（A）、奶粉添加量（B）以及发酵时间（E），以感官评分（Y）为响应值，利用Design-Expert.V.10软件进行Box-Behnken试验设计，响应面试验分析结果见表6，方差分析结果见表7。
表6 响应面试验设计与结果
Table 6 Design and results of response surface tests
表7 响应面试验结果方差分析
Table 7 Variance analysis of response surface tests results
续表
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响差异极显著（P＜0.01）。
通过对表6的试验数据进行三元二次回归拟合，得到响应面回归模拟方程：Y=+89.00-2.12A+2.38B+1.25E+3.75AB+0.50AC-0.50BE-4.38A2-8.88B2-6.62E2。从表7可得，该模型的P=0.0003＜0.001，极显著，则该模型具有统计学意义；失拟项P=0.0625＞0.05，不显著；回归方程决定系数R2=0.962 4，这都说明二次回归模型拟合度良好；调整决定系数R2Adj=0.914 0，说明该模型能解释91.40%响应值的变化，即试验得出的葛根酸奶发酵方案可用；变异系数（coefficientofvariation，CV）%=2.67%，较低，表明该模型的精确度较高。
各因素的交互作用对酸奶感官评分的影响见图6。如图6所示，两两因素之间对酸奶品质影响的响应面图和等高线图均存在最大值。葛根粉添加量与奶粉添加量的交互作用较强，对葛根酸奶品质的影响显著。葛根粉添加量和发酵时间、奶粉添加量和发酵时间两两因素的交互作用较弱，但存在最大响应值，等高线为圆形，对葛根酸奶品质的影响不显著。
图6 各因素交互作用对葛根酸奶感官评分的响应面图和等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory score of Pueraria yoghurt
根据Design-Expert V.10对实验的数据分析，依据得出的模型拟合结果，本实验的最佳工艺参数为：葛根添加量3.801%，奶粉添加量8.179%，发酵时间5.084 h，感官评分预测值为89.37分。考虑到操作的便利性，葛根酸奶发酵工艺参数修订为：葛根粉添加量3.8%，奶粉添加量8.2%，发酵时间5 h。以最佳发酵参数进行验证试验，结果葛根酸奶感官评分的实际值均值为90分，与预测值89.37分相差不大，表明该二次回归模型拟合度较好，也说明了通过响应面法可以优化葛根酸奶的配方，其回归方程也能够有效地对葛根酸奶的配方进行分析与预测。
2.5 葛根酸奶品质检测结果
2.5.1 感官评价
本实验优化得出的最佳方案制作的葛根酸奶呈乳白色，组织细腻，口感佳，酸奶味浓郁且具有葛根清香，酸甜适中，无乳清析出，不存在分层、气泡，感官评分为90分。
2.5.2 理化与微生物指标
最优发酵方案制得的葛根酸奶酸度为72°T；糖度为8.6%，符合现今社会追求的低糖食物风尚；乳酸菌数为1.3×108 CFU/mL，大肠杆菌未检出。以上理化及微生物指标检测结果均符合相关国家标准。
2.6 葛根酸奶抗氧化性检测结果
将葛根酸奶，2 mg/L VC以及原味酸奶对DPPH自由基、羟基自由基清除率进行测定，结果见图7。由图7可知，酸奶均具有抗氧化性，但葛根酸奶总体上抗氧化性能强于原味酸奶，但比2 mg/L的VC的抗氧化性能弱。
图7 不同样品对DPPH自由基（A）、羟自由基（B）的清除率
Fig.7 Scavenging rate of different samples on DPPH (A) and hydroxyl radicals (B)
3 结论
本次实验优化的葛根酸奶组织细腻，口感佳，酸奶味浓郁且具有葛根清香，酸甜适中，无乳清析出，响应面优化后，感官评分达到90，与预测值相近。葛根酸奶的酸度为72°T，糖度为8.6%，乳酸菌数为1.3×108 CFU/mL，大肠杆菌未检出。以上检测结果均符合各项相对应的国家标准；葛根酸奶清除DPPH自由基以及羟自由基的能力高于自制原味酸奶，由此说明葛根酸奶是一种值得开发的益生乳品。
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