大曲通常是指以大麦、豌豆为原料，通过自然发酵制作的曲，富含多种霉菌、酵母和细菌[1-3]，为山西老陈醋酸、醇、酯等风味物质的生成奠定了基础[4]。麸曲是指以麸皮为主要原料，接种霉菌进行纯种培养的曲，目前主要用于白酒及食醋的酿造[3]，其主要起糖化作用。由于微生物种群的单一，麸曲在食醋等的酿造过程中并不单独使用[5-6]，而是与大曲作为发酵剂同时使用[7-8]。这样的用曲方式，既能使陈醋具有山西老陈醋的特色风味，又能缩短发酵周期，但其大曲用量仍然占到山西老陈醋大曲用量的60%以上。
传统大曲制作步骤繁琐，劳动强度大，生产周期长达4个月以上[9]，受气候影响[10]，生产效率不高，且生产、库存占地面积大。而麸曲采用人工纯种培养，便于机械化生产，生产成本低、周期短。在陈醋生产过程中，大曲与麸曲的结合使用，虽然有益于提高陈醋产品的品质，但由于陈醋市场需求逐渐增大，而大曲生产量受限，加大了企业大曲供应压力。现阶段，为减少传统大曲的用量，大多数研究倾向于筛选其中的优良菌种，先分别制备纯种大曲或麸曲等，而后与传统大曲混合使用[11-12]。
以大曲为种曲制备强化麸曲，充分结合大曲微生物种群丰富及麸曲培养周期短的特点，将大曲中的优势微生物种群通过较短时间的培养加以富集，使强化麸曲具备大曲所具有的糖化力及发酵力。本试验以大曲为种曲制备强化多微麸曲，以糖化力及发酵力为响应值，通过单因素及响应面试验对强化多微麸曲的制备工艺进行优化。并在陈醋酒精发酵阶段进行了投料试验，旨在探究使用强化多微麸曲替代部分麸曲及大曲用量在陈醋生产中应用的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大曲：山西紫林醋业股份有限公司自制；麸皮、稻壳、豆粕粉、粗麦粉：市售；氢氧化钠、盐酸、葡萄糖、碘、碘化钾、硫酸铜、酒石酸钾钠、硫酸、可溶性淀粉、乙酸、乙酸钠、己酸、乙醇等（均为分析纯或生化试剂）：天津欧博凯化工有限公司；次甲基蓝（分析纯）：天津市光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
202型电热恒温干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司；AR124CN电子天平、ZL-002 pH计：奥豪斯仪器有限公司；DZKW-4电子恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；Alkomat酒精检测仪：福林斯（徐州）生化技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 强化多微麸曲制备工艺流程
以麸皮为主要原料，加水，拌匀，100～120 ℃条件下蒸料25～35 min，取5%～8%的蒸煮麸皮在10～30 min内冷却至32～36 ℃，与大曲搅拌均匀，堆积2～3 h，之后接种到已冷却的剩余蒸煮麸皮中进行培养，进而得到成曲。
春末夏初时，气温及湿度都比较高，有利于控制曲室的培养条件[13]，是最好的压曲季节[10]。因此，试验所用种曲均为春末夏初时所制大曲，其水分含量≤13%，酸度为0.5%～1.3%，糖化力≥900.0 mg/（g·h），液化力≥1.0 g/（g·h），发酵力≥2.0 g/（0.5 g·72 h），酯化力≥600.0 mg/（50 g·7 d）。
1.3.2 强化多微麸曲制备工艺优化单因素试验
加水量的确定：以麸皮用量为参照，选取加水量分别为40%、45%、50%、55%、60%，种曲（即大曲）添加量为1%，培养温度为35 ℃，培养时间为40 h，进行强化多微麸曲的制备，以糖化力及发酵力作为评价指标，确定最佳的加水量，每个处理平行3次。
种曲添加量的确定：以麸皮用量为参照，选取加水量为45%，大曲添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%，培养温度为35 ℃，培养时间为40 h，进行强化多微麸曲的制备，以糖化力及发酵力作为评价指标，确定最佳的种曲添加量，每个处理平行3次。
培养温度的确定：选取加水量为45%，种曲添加量为1%，培养温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃，培养时间为40 h，进行强化多微麸曲的制备，以糖化力及发酵力作为评价指标，确定最佳的培养温度，每个处理平行3次。
培养时间的确定：选取加水量为45%，种曲添加量为1%，培养温度为35 ℃，分别培养30 h、35 h、40 h、45 h、50 h，以糖化力及发酵力作为评价指标，确定最佳的培养时间，每个处理平行3次。
1.3.3 强化多微麸曲制备工艺优化响应面试验
在单因素试验基础上，采用Design-Expert8.0.6软件进行Box-Behnken中心组合试验设计[14]，选取加水量（A）、种曲添加量（B）、培养温度（C）及培养时间（D）4个因素作为试验因素，以强化多微麸曲的糖化力（Y1）及发酵力（Y2）为响应值，设计响应面分析试验，其因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments
1.3.4 强化多微麸曲陈醋酒精发酵的应用
高粱经润料、蒸料后冷却至60～65 ℃，加入麸曲糖化2～3 h，继续降温至25～30 ℃，加入大曲，进行酒精发酵，发酵前3天敞口进行，之后封口进行，发酵周期15～16 d。
将制备的强化多微麸曲部分替代大曲及麸曲应用于陈醋酒精发酵阶段，具体添加量见表2。酒精发酵阶段结束后，测定酒醪的酒精度、酸度、还原糖及淀粉含量。
表2 陈醋酒精发酵阶段原料配方
Table 2 Raw material formula of aged vinegar during alcohol fermentation
1.3.5 检测方法
强化麸曲糖化力及发酵力测定方法采用轻工行业标准QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[15]测定；酒醪酸度的测定采用酸碱中和滴定法[16]；还原糖含量的测定采用菲林试剂法[17]；淀粉含量的测定采用酸水解法[18]；酒精度的测定[16]：取100 g酒醪加入100 mL蒸馏水，蒸馏出100 mL溶液，用酒精检测仪测定酒精度。
2 结果与分析
2.1 强化多微麸曲制备工艺优化单因素试验
2.1.1 加水量对强化多微麸曲质量的影响
由图1可知，加水量为55%时，强化麸曲的糖化力最高，为623 mg/（g·h）；加水量为45%时，强化麸曲的发酵力最高，为0.54 g/（0.5 g·72 h），因此，加水量的确定需综合衡量强化麸曲糖化力及发酵力决定。
图1 加水量对强化多微麸曲的影响
Fig.1 Effect of water addition on fortified Fuqu with multi-microorganisms
2.1.2 种曲添加量对强化麸曲质量的影响
图2 种曲添加量对强化多微麸曲的影响
Fig.2 Effect of seed Daqu addition on fortified Fuqu with multi-microorganisms
由图2可知，当种曲添加量为2%时，强化麸曲的糖化力及发酵力最高，分别为579 mg/（g·h）、0.75 g/（0.5 g·72 h）。因此，确定最佳种曲添加量为2%。
2.1.3 培养温度对强化多微麸曲质量的影响
图3 培养温度对强化多微麸曲的影响
Fig.3 Effect of culture temperature on fortified Fuqu with multi-microorganisms
由图3可知，当培养温度为40 ℃时，强化麸曲的糖化力最高，为594 mg/（g·h）；当培养温度为35 ℃时，发酵力最高，为0.80 g/（0.5 g·72 h）。由于35 ℃与40 ℃培养条件下，强化麸曲糖化力差异较小，因此，培养温度选择35 ℃为宜。
2.1.4 培养时间对强化多微麸曲质量的影响
图4 培养时间对强化多微麸曲的影响
Fig.4 Effect of culture time on fortified Fuqu with multi-microorganisms
由图4可知，培养时间为40 h时，强化麸曲的糖化力及发酵力均达到最大，分别为615 mg/（g·h）、0.89 g/（0.5 g·72 h）。因此，确定最佳培养时间为40 h。
2.2 强化多微麸曲制备工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，运用Design-Expert.V8.6.0.1软件对水分含量（A）、种曲添加量（B）、培养温度（C）及培养时间（D）进行响应面优化，试验结果及分析见表3，方差分析结果见表4。
运用Design-Expert.V8.6.0.1软件对中心组合试验数据进行多元回归拟合分析，得到糖化力（Y1）及发酵力（Y2）的二次多项回归方程：
由表4可知，以糖化力为响应值构建的模型的P值＜0.000 1，极显著。失拟项的P值=0.164 1＞0.05，不显著。决定系数R2=95.59%，校正决定系数R2Adj=91.18%，说明模型与实际试验拟合度良好，可以用来对试验结果进行初步的分析及预测。根据回归方程的方差分析可知，各因素对糖化力影响的主次顺序为培养时间＞培养温度＞加水量＞种曲添加量。一次项A、C、D及二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AD、BC、CD对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。各影响因素交互作用的响应曲面及等高线见图5。由图5可知，响应面均呈开口向下的图面，说明存在最大值。结合方差分析结果可知，对于强化多微麸曲的糖化力，其水分含量与培养时间、种曲添加量与培养温度、培养温度与培养时间之间存在显著的交互作用。
表3 Box-Benhnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Benhnken experiments
续表
表4 回归方程的方差分析
Table 4 Variance analysis for regression equation
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
由表4可知，以发酵力为响应值构建的模型的P值＜0.000 1，极显著。失拟项P值=0.453 8＞0.05，不显著。决定系数R2=95.02%，校正决定系数R2Adj=90.04%，说明模型与实际试验拟合度良好，可以用来对试验结果进行初步的分析及预测。根据回归方程的方差分析可知，各因素对发酵力影响的主次顺序为培养温度＞培养时间＞加水量＞种曲用量。一次项C、D、交互项AB、AD、CD及二次项A2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A、交互项BD对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。各影响因素交互作用的响应曲面及等高线见图6。由图6可知，响应面均呈开口向下的图面，说明存在最大值。结合方差分析结果可知，对于强化多微麸曲发酵力，其水分含量与种曲用量、水分含量与培养时间、种曲用量与培养时间、培养温度与培养时间之间存在显著的交互作用（P＜0.05），且除种曲用量与培养时间之间的交互作用为显著外，其余均为极显著（P＜0.01）。
图5 水分含量、种曲添加量、培养温度和培养时间交互作用对糖化力影响的响应曲面与等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between water content,seed Daqu addition,culture temperature and time on saccharifying power
图6 水分含量、种曲添加量、培养温度和培养时间交互作用对发酵力影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between water content,seed Daqu addition,culture temperature and time on fermenting power
运用Design-Expert.V8.6.0.1软件对糖化力（Y1）及发酵力（Y2）的二次多项回归方程进行最优化求解，得到的最佳工艺参数条件为加水量50.97%、种曲添加量1.93%、培养温度34.36 ℃、培养时间41.96 h。该条件下所制备的强化多微麸曲的糖化力理论值为618.80 mg/（g·h），发酵力理论值为1.12 g/（0.5 g·72 h）。为便于实际操作，将工艺参数修正为加水量51.0%、种曲添加量2.0%、培养温度34.5 ℃、培养时间42.0 h。采用修正后的工艺参数条件进行3次重复试验，测得强化多微麸曲糖化力平均实际值为615.9 mg/（g·h），发酵力平均实际值为1.14 g/（0.5 g·72 h），与预测值基本一致，因此，采用响应面法预测强化多微麸曲的制备工艺参数是可行的。
2.3 强化多微麸曲在陈醋酒精发酵中的应用
表5 强化多微麸曲应用于陈醋酒精发酵试验结果
Table 5 Results of the fortified Fuqu with multi-microorganisms application in alcohol fermentation of aged vinegar
注：同一列不同字母表示各试验组间存在显著性差异（P＜0.05）。
由表5可知，当使用强化多微麸曲替代25%麸曲，而大曲添加量不变时，酒醪的酒精度和淀粉含量显著高于对照组（P＜0.05），分别升高2.75%和42.55%，酸度和还原糖含量显著低于对照组（P＜0.05），分别降低3.75%和26.31%，说明强化多微麸曲替代25%麸曲时，除淀粉含量变化趋势劣于对照组外，酒精度、酸度及还原糖含量的变化趋势优于对照组；当使用强化多微麸曲替代25%大曲，而麸曲用量不变时，与对照组相比，酒醪酒精度和还原糖含量差异不显著（P＞0.05），酸度显著高于对照组（P＜0.05），升高21.43%，淀粉含量显著低于对照组（P＜0.05），降低13.48%，说明强化多微麸曲替代25%大曲时，酸度变化趋势劣于对照组，而淀粉含量的变化趋势优于对照组；当使用强化多微麸曲替代25%大曲和25%麸曲时，酒醪的酒精度和酸度显著低于对照组（P＜0.05），分别降低7.23%和10.12%，还原糖含量与对照组相比差异不显著（P＞0.05），淀粉含量显著高于对照组（P＜0.05），降低130.49%，该组试验结果的总体变化趋势劣于对照组，尤其是在淀粉的利用上更为突出，其原因可能是由于在该组用曲情况下，淀粉转化为葡萄糖的量减少，进一步导致乙醇生成量减少。对比使用强化多微麸曲单独替代25%的麸曲或25%大曲时的结果，同时替代二者时应注意增加麸曲的用量，以加强对淀粉的分解利用。以上结果表明，在陈醋酿造酒精发酵阶段，以强化多微麸曲替代部分大曲及麸曲是可行的，但最佳的替代量仍需通过进一步试验确定[19-20]。
3 结论
本试验通过单因素及响应面试验的优化，得到了以大曲为种曲制备强化多微麸曲的工艺条件：加水量51.0%、种曲添加量2.0%、培养温度34.5 ℃、培养时间42.0 h。在此优化条件下，强化多微麸曲的糖化力为615.9 mg/（g·h），发酵力为1.14 g/（0.5 g·72 h）。该强化麸曲富集了大曲中的优势菌群，制备工艺相对简单，过程控制便于管理，利于实现机械化生产。将其应用于陈醋酿造的酒精发酵阶段，结果表明，该强化麸曲可以替代部分大曲及麸曲，但最佳的替代量及对应的酒精发酵的周期需进一步试验确定。
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