黑加仑（Ribes nigrum L.）学名黑穗醋栗，俗称黑豆果或紫梅[1]，属虎耳草科茶藨子属，多年生小型灌木植物[2]。果实为球状黑色，味道酸甜可口，主要分布在新疆阿勒泰、伊犁河谷、黑龙江及辽宁等地区[3]。黑加仑果实含有丰富的营养物质，如有机酸、维生素、黄酮类物质、矿物质、生物类黄酮、花青素、酚类物质[4-5]、多糖等生物活性物质。其中维生素C含量特别高；鲜果中花青素含量可达到90 mg/100 g，花色苷含量可达172 mg/100 g[2]。因此，黑加仑可预防心脑血管疾病，改善视力，具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血压等功效[6-12]。所以，黑加仑有很大的市场价值和开发潜力，黑加仑产品以果汁和果酒为主。
以新鲜黑加仑果为原料，经过酵母菌发酵而成的低度果酒很受消费者欢迎。黑加仑果酒在发酵过程中，还原糖含量的下降、酵母菌数目的生长以及酒精度的变化都有一定的规律。发酵动力学是对微生物生长和产物形成过程的定量描述，研究发酵过程中菌体的生长、底物消耗和产物合成之间的动态平衡及内在规律。果酒发酵动力学主要研究菌体数目的变化、糖的消耗以及酒精度的生成情况。目前，关于发酵动力学的研究较多，如李敏杰等[13]对莲雾果酒发酵过程中酵母菌的数量、酒精度、总糖含量随时间的变化情况进行非线性拟合，其拟合度R2分别为0.949、0.979、0.997，能较好反映莲雾果酒发酵过程中各项指标的变化情况；张琪等[14]对沙棘果酒发酵过程中酵母菌的数量、酒精度、总糖含量随时间的变化情况进行非线性拟合，拟合度均＞0.95，为沙棘果酒发酵提供理论基础。李雪等[15]使用Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型进行了非线性拟合，3种模型的预测值和测量值的拟合值均＞0.99。靳梦楚等[16]采用Logistic和DoseResp模型对红心火龙果果酒不同发酵时期的酵母菌数目、酒精度、残糖量进行非线性拟合，拟合度均＞0.99，能较好地描述发酵中的动力学特征。这些模型均具有良好的拟合效果，可以很好的反映出果酒发酵过程中酵母菌数量，酒精含量和糖的含量的动态变化，有利于工业化生产。
本试验拟采用经典的Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型和Boltzmann模型，对黑加仑果酒发酵过程中酵母数量的变化、酒精生成和还原糖消耗情况进行非线性拟合，建立发酵动力学模型，通过对黑加仑果酒发酵动力学的研究，可以为控制黑加仑果酒的发酵生产提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑加仑果（可溶性固形物含量12%）：购于黑龙江省农科院浆果研究所；RV171型葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品级）：黑龙江北方糖业股份有限公司；Pectinex XXL果胶酶（酶活10 000 U/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司；3,5-二硝基水杨酸、福林酚（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；偏重亚硫酸钠（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
WS108手持式折光仪：河北润联科技开发有限公司；HR7633打浆机：飞利浦家庭电器（珠海）有限公司；DK-8D型电热恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计：上海凌析仪器有限公司；L420台式低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；DRP-9082型电热恒温培养箱；YS100尼康生物显微镜：日本尼康公司；EX324电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑加仑果酒发酵工艺流程与操作要点
黑加仑果→挑选→打浆→酶解→调整糖度→杀菌→接种→恒温发酵→黑加仑果酒
操作要点：
取一定量的黑加仑果，用打浆机打浆，测其可溶性固形物的含量[17]。用果胶酶进行酶解，酶解温度为45～50 ℃，酶解时间3 h[18]。加入白砂糖调整果浆糖度至21°Bx，加入40 mg/kg的SO2，并冷却至室温。取一定量的干酵母，溶于其10倍体积的黑加仑汁和蒸馏水（两者体积比为1∶2）中，在35 ℃条件下将酵母菌活化30 min。接种前在60 ℃条件下杀菌30 min，然后冷却至室温，接入5%活化好的酵母菌，于21 ℃条件下恒温发酵一定时间，得到黑加仑果酒。
1.3.2 发酵动力学主要指标的测定方法
（1）酵母菌数量：将发酵液取出用蒸馏水稀释一定倍数，滴于血球计数板上，在光学显微镜下直接计数。
（2）还原糖含量测定：采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的质量浓度[19]。葡萄糖标准曲线回归方程：y=0.538 9x-0.016 1，相关系数R2=0.997 2。
（3）酒精度测定：采用先蒸馏，然后用密度瓶法测定黑加仑果酒的酒精度[20]。
（4）可溶性固形物测定：取少量液体样品，置于手持式折光仪上，进行读数。
1.3.3 动力学模型建立方法
酵母菌生长动力学模型拟合：采用典型的“S”曲线模型：通过非线性拟合Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型，并对三种模型拟合程度进行比较。相关系数（R2）越大，拟合度越高，最后选择相关系数最大的模型来描述[15]。
酒精生成动力学模型拟合：在酵母菌生长的过程中会利用还原糖产生酒精，所以酒精的生成与酵母的生长有着直接的关系，属于生长“耦联”型。所以选择“S”型曲线：Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型进行拟合，选取相关系数最大的模型描述酒精度的变化。
还原糖含量动力学模型拟合：在黑加仑果酒的发酵过程中，还原糖主要用于生产酒精。选用经典模型中的Logistic模型、Botlzman模型与DoseResp模型进行非线性拟合，拟合后选取相关系数最大的模型描述还原糖含量的变化。
2 结果与分析
2.1 黑加仑果酒发酵过程中酵母菌数量、酒精度以及还原糖含量的变化
图1 黑加仑果酒发酵过程中酒精度、酵母菌数、还原糖含量变化
Fig.1 Changes of alcohol content,yeast count and reducing sugar content during the fermentation of blackcurrant fruit wine
由图1可知，发酵初期，24 h之前酵母菌生长较缓慢，该过程酵母菌代谢系统适应发酵环境，表现为菌体数量增加较慢；果酒发酵24 h后，酵母菌进入指数生长期，在短暂适应期后，糖分被菌体快速消耗，菌体数量以几何级数增长；发酵到达144 h后，由于体系基质消耗殆尽，代谢产生的酒精积累在一定程度上也抑制菌体生长[21]，菌体生长进入稳定期，酵母菌数量最高达1.035×108 CFU/mL。酵母菌利用还原糖代谢产生酒精，发酵过程中，前24 h酒精度变化缓慢，酒精度0.15%vol左右，这与酵母适应新环境和氧气浓度较高有关，随着酵母菌指数生长期即在24～96 h呈快速增长趋势；此时酵母菌迅速繁殖，并消耗还原糖，144 h后，酒精度的增加也比较缓慢，在240 h，黑加仑酒的酒精含量最高，达到10.61%vol。
发酵体系的还原糖含量随着发酵时间的增加而降低，为酵母菌代谢提供所需能量，还原糖逐渐被代谢生成酒精。在发酵24～96 h，体系还原糖含量迅速下降；144 h后，酵母菌数量与酒精度增长缓慢的同时，还原糖含量也缓慢下降，240 h时还原糖含量下降至1.99 g/L，发酵结束。
2.2 酵母菌的生长动力学模型
酵母菌数的不同模型下的拟合方程及相关系数见表1。由表1可知，对Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型的拟合相关系进行了比较后可以得出：不同模型中拟合方程的R2值没有显著性差异，Logistic模型的拟合效果较好，拟合相关系数R2为0.986 45。因此，实验中使用Logistic模型来拟合黑加仑酒中的酵母生长，酵母菌数量的实际值和拟合曲线见图2。由图2可知，酵母菌经过一段时间的适应期，在黑加仑果酒发酵24 h后生长速率开始提高，24～96 h酵母菌为对数生长，144 h后，酵母几乎不再生长，趋于平稳，进入稳定期。
表1 酵母菌数的拟合方程及其相关系数
Table 1 Fitting equation of yeast count and its correlation coefficients
图2 Logistic模型（A）及实测值（B）下酵母菌生长拟合曲线
Fig.2 Fitting curves of yeast growth under the Logistic model (A) and measured value (B)
2.3 酒精度动力学模型
Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型对酒精度的拟合方程以及相关系数见表2。由表2可知，拟合相关系数分别是0.997 69、0.997 24、0.99 42。不同模型中拟合方程的R2值没有显著性差异，其中，Logistic模型的拟合相关系数R2略高，为0.997 69，表明该模型可以较好地描述黑加仑果酒发酵过程中酒精度的变化。因此，本实验选择Logistic模型来拟合产物生成曲线，其拟合曲线见图3。由图3可知，酒精度在192 h后趋于平缓，最大值为10.61%vol。
表2 酒精生成拟合方程及相关系数
Table 2 Fitting equation and correlation coefficient of alcohol formation
图3 Logistic模型（A）及实测值（B）下酒精度的拟合曲线
Fig.3 Fitting curves of alcohol under Logistic model (A) and measured value (B)
2.4 还原糖含量动力学模型
DoseResp模型、Logistic模型和Boltzmann模型对还原糖含量的拟合方程及相关系数见表3。由表3可知，不同模型中拟合方程的R2值没有显著性差异，Logistic模型拟合效果较好，拟合相关系数R2为0.996 22。该模型能够较好地反映黑加仑果酒发酵过程还原糖含量的变化。因此，选用Logistic模型拟合基质消耗过程，结果见图4。由图4可知，发酵前96 h，还原糖消耗速度逐渐增大，在144 h后，酵母菌数目和酒精度的变化趋于稳定，残糖量下降速度也逐渐变缓；发酵216 h时，还原糖含量降到2.059 g/L，这也标志着发酵结束。因此，实际生产中，可通过检测黑加仑发酵果酒体系中的还原糖含量，来判断果酒的发酵是否结束[22]。
表3 还原糖含量的拟合方程及其相关系数
Table 3 Fitting equation of reducing sugar content and its correlation coefficient
图4 Logistic模型（A）及实测值（B）下还原糖消耗拟合曲线
Fig.4 Fitting curves of reducing sugar consumption under the Logistic model (A) and measured value (B)
3 结论
通过对黑加仑果酒发酵过程中酵母菌数、还原糖含量和酒精含量分别进行数据分析，Logistic模型，DoseResp模型，Boltzmann模型和SGompertz模型等发酵动力学经典模型对黑加仑果酒发酵均呈现较好的拟合效果，上述模型均能很好的描述黑加仑果酒发酵动力学特征，可以对其发酵过程进行定量分析和对实验最终指标进行预测。
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