蓝莓是一种营养价值较高的水果，既可鲜食又可深加工成果汁、果酒、果酱。蓝莓中含有丰富的花色苷，是由花色素和糖苷结合而成[1]，可赋予植物的花朵、果实等器官以不同的颜色[2]，它还是一种极其有效的天然水溶性自由基清除剂，具有清除自由基、延缓衰老、抗氧化等多种生理功能[3-5]，其淬灭自由基的能力，是维生素C（vitamin C，VC）的20倍、维生素E（vitamin E，VE）的50倍[6]，柳嘉等[7]研究40种富含花色苷的蔬菜和水果表明，蓝莓的花色苷含量最高，被评为“人类五大健康食品之一”[8]、列入世界第3代水果行列[9]。近年来，由于植物花色苷色泽鲜亮、水溶性高，安全性强，有取代人工色素的趋向[10]，因此蓝莓花色苷的提取与利用也受到食品加工业的广泛关注。
胶东半岛是我国蓝莓的主要采摘区之一[11]，蓝莓品种以高丛蓝莓为主，高丛蓝莓花色苷种类少、含量低[12]，但蓝莓的高含量花色苷是其重要果实品质，因此，选育人工栽培模式下，色素含量丰富、品质优良的高丛蓝莓品种具有较大的市场潜力。据调查，胶东地区的蓝莓主栽品种蓝丰的连续丰产能力强，但果实风味平淡、糖酸比偏低，受欢迎程度已逐年下降；莱格西也是胶东地区栽培面积较广的品种之一，土壤适应性强、栽培管理容易、耐储运，在胶东半岛栽培面积较大；绿宝石和珠宝均是20世纪90年代由佛罗里达选育的新品种，产量较高、风味较好，已成为加利福尼亚州、佛罗里达州及多数东南地区主导的高丛品种[13]，近几年，二者在胶东地区的栽培面积迅速扩大，发展迅猛，果实风味浓厚、果皮颜色较深，深受欢迎，但未见到二者花色苷单体种类及含量的相关研究报道，因此，本实验采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（ultra performanceliquid chromatography-quadrupole-time of flight-tandemmass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS/MS）联用技术，测定了胶东地区4个主栽蓝莓品种的花色苷单体种类及含量，并对其抗氧化活性高低进行了比较，以期为胶东半岛功能性品种的推广提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝丰、莱格西、珠宝、绿宝石：均采自山东省烟台市农业科学研究院海阳蓝莓种植基地。
2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）、福林酚试剂、1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：美国Sigma公司；花青素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy）（纯度≥98%）：苏州科铭生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
GL-20G-Ⅱ离心机：中国安科公司；ZMD 4000高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）仪：美国Waters公司；PB-10 pH计：德国Sartorius公司。
1.3 试验方法
1.3.1 实验样品来源及预处理
实验于山东省烟台市农业科学研究院海阳蓝莓种植基地进行。实验地属温带湿润性季风气候，年平均降水量524.9 mm，年平均气温13.4 ℃，年平均日照时数2 488.9 h。供试蓝莓品种为蓝丰、莱克西、珠宝和绿宝石。实验所用蓝莓苗木均定植于2013年，南北行向种植，株距0.8 m，行距2 m，栽培管理措施一致。每个品种选择长势一致的植株，10株为一小区，重复3次，计30株。果实达到商品成熟时，每株蓝莓采集10粒果实。部分浆果液氮冷冻后贮藏于-20 ℃供次生代谢产物测定，其余浆果剥皮，果皮单独成包，每个品种5包，液氮冷冻后贮藏于-80 ℃，供花色苷单体测定。
1.3.2 次生代谢产物的测定
Folin-Ciocalteu法[12]测定果实总酚含量、亚硝酸盐-氯化铝法[14]测定果实类黄酮含量、pH示差法[15]测定果实花色苷含量。
1.3.3 花色苷类物质的提取与测定
蓝莓果实花色苷的提取参照刘芸等[12]的实验方法，略有改动。准确称取蓝莓果皮0.500 0 g，加入5 mL含5%甲酸的甲醇溶液，超声提取15 min，于10 ℃、12 000 r/min的条件下离心20 min，收集上清液，继续用5 mL含5%甲酸的甲醇溶液超声提取残渣20 min，于10 ℃、12 000 r/min的条件下离心20 min，合并2次提取的上清液，定容至10 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行液相检测。
花色苷的测定采用UPLC-Q-TOF-MS/MS，定性工作基于已有文献中的紫外光谱图、质谱图和保留时间等信息的比对分析[14，16]。质谱结果用Mass Lynx V4.1（Waters）分析软件进行分析，物质结构的鉴定参考标准物质及郭晓倩等[17]的方法。
标准物质为花青素-3-O-葡萄糖苷（y），其他花色苷以相当于Cy含量计。将花色苷按构成花色素基本单元分为四类：花翠素类、花青素类、甲基花翠素类、二甲花翠素类。
1.3.4 体外抗氧化活性的测定
DPPH自由基清除率、铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）还原力的测定参考陈纯[18]的方法、ABTS清除率参考杨延峰等[19]的方法。
1.3.5 数据处理
数据整理及作图均采用Excel 2010，方差分析采用DPS 7.05。
2 结果与分析
2.1 不同品种蓝莓酚类物质含量分析
不同品种蓝莓酚类物质含量分析见图1。由图1可知，绿宝石的总酚和花色苷在所有品种中最高，总酚含量达13.11 mg/g，比蓝丰显著提高29.10%（P＜0.05），花色苷含量达2.26 mg/g，是蓝丰花色苷含量的2.66倍；珠宝的花色苷含量比蓝丰显著提高86.47%（P＜0.05），总酚和类黄酮与蓝丰无显著差异（P＞0.05）；莱格西的类黄酮含量达蓝丰的2.41倍，但与绿宝石的类黄酮含量无显著差异（P＞0.05）。
图1 不同品种蓝莓酚类物质含量分析
Fig.1 Analysis of phenolic compounds contents in different blueberry varieties
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 不同品种蓝莓花色苷单体特性分析
不同品种蓝莓花色苷单体种类及含量分析见表1。由表1可知，4种蓝莓的花色苷整体结构以单糖二聚体为主，糖苷为半乳糖糖苷、葡萄糖糖苷和阿拉伯糖苷，以葡萄糖苷种类最多。
表1 不同品种蓝莓花色苷单体分析
Table 1 Analysis of anthocyanin monomers in different blueberry varieties
注：C1，花青素-3-O-葡萄糖苷；C2，花青素-3-O-阿拉伯糖苷;D1，花翠素-3-O-半乳糖苷；D2，花翠素-3-O-葡萄糖苷；D3，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷；D4，花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷；M1，二甲花翠素-3-O-半乳糖苷；M2，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷；M3，二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷；P1，甲基花翠素-3-O-半乳糖苷；P2，甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷；P3，甲基花翠素-3-O-阿拉伯糖苷；P4，甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-葡萄糖苷；“-”表示未检出。下同。
从花色苷单体组成来看，蓝丰、莱格西和绿宝石均检测到11种花色苷单体，均以甲基化修饰为主，花翠素类、甲基花翠素类和二甲花翠素类花色苷单体各检测到3种单体，花青素类花色苷检测到2种单体；珠宝中则检测到13种花色苷单体，出现酰基化修饰花色苷单体——花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰化）-葡萄糖苷。
从花色苷单体含量来看，蓝丰含量最高的是二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷，但含量仅为1 717.64 mg/kg，二甲花翠素-3-O-半乳糖苷含量次之，而莱格西、绿宝石和珠宝中则是以二甲花翠素-3-O-半乳糖苷含量最高，含量分别达3 536.26 mg/kg、3 737.84 mg/kg、3 481.35 mg/kg，莱格西和绿宝石含量次高的花色苷单体为花翠素-3-O-半乳糖苷，而珠宝含量次高的花色苷单体为二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，此外，珠宝的花翠素-3-O-半乳糖苷和花翠素-3-O-阿拉伯糖苷含量也达2 000 mg/kg，其花色苷单体含量在2 000 mg/kg以上的花色苷种类最多，占总数的30.11%，莱格西和绿宝石均占18.18%，蓝丰为0。不同种类花色苷比较可知，花青素类花色苷单体种类少、含量低，仅检测到2种，且含量均≤100 mg/kg，花青素-3-O-阿拉伯糖苷含量以莱格西最高，而花青素-3-O-葡萄糖苷则以珠宝含量最高。
将所有检测品种进行花色苷总量比较可得，仅蓝丰花色苷总含量不足6 000 mg/kg，莱格西和绿宝石含量在10 000～20 000mg/kg，珠宝含量最高，为20 237.68 mg/kg，是蓝丰花色苷总量的3.43倍，比莱格西含量显著提高81.01%（P＜0.05），与绿宝石无显著差异（P＞0.05）。
由此可见，不同品种蓝莓糖苷键无差异，但主要花色苷单体不同；珠宝花色苷单体种类更丰富、花色苷总含量更高，绿宝石次之。
2.3 不同品种蓝莓花色苷相对含量分析
不同品种蓝莓花色苷相对含量分析结果见图2。由图2可知，蓝丰以二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷单体占比最高，其余三者则均以二甲花翠素-3-O-半乳糖苷单体占比最高，蓝丰有二甲花翠素-3-O-半乳糖苷、二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷3种单体含量占比达10%以上，而莱格西花色苷单体占比大部分在10%～20%，绿宝石和珠宝则大多在10%左右。
从单体组分相对含量相似度来看，蓝丰的二甲花翠素-3-O-半乳糖苷和二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷占比在25%以上，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占比在10%左右，花翠素-3-O-半乳糖苷、甲基花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-半乳糖苷以及甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷含量占比均在5%左右；莱格西的二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和花翠素-3-O-半乳糖苷占比在15%以上，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和甲基花翠素-3-O-半乳糖苷占比在10%左右；绿宝石花色苷单体占比次高的为花翠素-3-O-半乳糖苷，占18.06%，花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷和甲基花翠素-3-O-半乳糖苷占比均在10%左右，花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-阿拉伯糖苷占比均在5%左右；珠宝的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占比仅比二甲花翠素-3-O-半乳糖苷少0.03%，花翠素-3-O-半乳糖苷占比接近15%，花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷、甲基花翠素-3-O-半乳糖苷和甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷的占比均在10%左右。
图2 不同品种蓝莓花色苷单体相对含量分析
Fig.2 Analysis of relative content of anthocyanin monomers in different blueberry varieties
由此可见，绿宝石和珠宝各种花色苷单体含量比例相对均衡；组分组成相似，均与蓝丰有较大差异。
图3 不同品种蓝莓花色苷组成相对含量分析
Fig.3 Analysis of relative contents of anthocyanin composition in different blueberry varieties
花色苷单体按花色素基本单元分类结果见图3。由图3可知，各品种均以二甲花翠素类花色苷为主，占比达41%～68%，花翠素类花色苷占比次之，比例为17%～34%，花青素类花色苷占比最低，均为1%；蓝丰花色苷基本单元组成与莱格西、珠宝、绿宝石相差较大，珠宝和绿宝石花色苷组成极为相似。联合花色苷含量分析得，珠宝的花青素类、甲基花翠素类、花翠素类花色苷含量分别达蓝丰的4.47倍、5.14倍、7.10倍，为莱格西的1.76倍、2.15倍、2.00倍，分别比绿宝石显著提高14.61%、27.81%、49.89%（P＜0.05），同时，珠宝的二甲花翠素类花色苷分别比蓝丰、莱格西显著提高93.30%、41.54%（P＜0.05），但与绿宝石未形成显著性差异（P＞0.05）。
由此可见，二甲花翠素类花色苷是蓝莓的主要花色苷，花翠素类、甲基花翠素类花色苷占比次之，花青素类花色苷占比最低；莱格西、珠宝和绿宝石花色苷组分相似，珠宝和绿宝石相似度极高，可能存在一定的亲本关系。
2.4 不同品种蓝莓花色苷抗氧化活性分析
不同品种蓝莓花色苷抗氧化活性分析结果见图4。由图4可知，所测品种的ABTS自由基清除率均在0.98以上，无显著差异（P＜0.05）；DPPH自由基的清除率以珠宝最高，达72.02%，比蓝丰显著提高58.25%（P＜0.05），但与绿宝石和莱格西未形成显著差异（P＞0.05）；就总还原力来看，珠宝、绿宝石和莱格西的FRAP值均高于2.0 mmol/L，分别比蓝丰显著提高62.29%、55.95%和43.29%（P＜0.05），即珠宝、绿宝石和莱格西的总还原力均显著高于蓝丰（P＜0.05）。
图4 不同品种蓝莓花色苷抗氧化活性分析
Fig.4 Antioxidant activity of anthocyanins of different blueberry varieties
3 讨论
品种是决定果实的营养物质组成和含量的重要因素。次生代谢产物的生物合成由结构基因和调节基因共同调控[20-21]。本实验中4个品种蓝莓的总酚、类黄酮和花色苷差异显著，可能是由于品种影响调控基因的表达，从而影响了花色苷的种类和含量[22]；实验所检测到的花色苷单体种类、糖苷键种类与张美娇等[23-24]研究结果一致，但均未检测出甲基花青素类花色苷，且蓝莓的主要花色苷单体并非花青素-3-O-半乳糖苷，与前人研究结果不同[25-26]，这可能与蓝莓的生长环境、地域条件有关[27-28]。
酚类物质是决定植物抗氧化活性的重要物质。前人研究表明[29-30]，植物多酚类和黄酮类物质具有较强的抗氧化活性，在多酚氧化酶的作用下可高效生成萘醌类化合物，并产生自由基。本实验研究显示，珠宝和绿宝石的总酚含量较高、类黄酮类物质含量偏低，但二者的DPPH自由基清除率和总还原力均较强，这可能与花色苷的结构、组成与含量有关[31-32]，实验中，珠宝和绿宝石的花色苷含量、甲基化程度均较高，且珠宝检测到乙酰化花色苷，这均可在一定程度上提高珠宝和绿宝石果实的抗氧化性。
4 结论
珠宝和绿宝石的总酚、类黄酮和花色苷含量均较高，且二者的花色苷种类丰富、抗氧化活性强。蓝丰、莱格西、珠宝和绿宝石花色苷单体均以葡萄糖苷二聚体、二甲花翠素类花色苷为主；不同蓝莓品种主要花色苷组分不同，蓝丰以二甲花翠素-3-O-阿拉伯糖苷为主，莱格西、绿宝石和珠宝以二甲花翠素-3-O-半乳糖苷为主；珠宝和绿宝石花色苷单体组成极为相似，可能存在一定的亲本关系；对于胶东地区而言，可考虑将珠宝、绿宝石作为功能性主推蓝莓品种。
[1]曹雪丹，方修贵，赵凯，等.蓝莓花色苷研究进展[J].中国农学通报，2012，28（15）：221-226.
[2]孙建霞，张燕，胡小松，等.花色苷的结构稳定性与降解机制研究进展[J].中国农业科学，2009，42（3）：996-1008.
[3]刘荣，冷梅.笃斯越橘花色苷抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2012，33（15）：96-100.
[4]刘玮，钱慧碧，辛秀兰，等.蓝莓果渣中总黄酮的提取纯化及抗氧化性能的研究[J].食品科技，2011，36（2）：216-219.
[5]LIU Y X,SONG X,HAN Y,et al.Identification of anthocyanin components of wild Chinese blueberries and amelioration of light-induced retinal damage in pigmented rabbit using whole berries[J]. J Agr Food Chem,2011,59(1):356-363.
[6]BAKOWSKA A,KUCHARSKA A Z,OSZMIANSKI J.The effects of heating,UV irradiation,and storage on stability of the anthocyanin-polyphenol copigment complex[J].Food Chem,2003,81(3):349-355.
[7]柳嘉，赵竞，景浩.笃斯越桔多酚提取物成分分析及其抗氧化活性的研究[J].食品科技，2009，34（9）：220-224.
[8]陈乃东，周守标，王春景，等.春花胡枝子黄酮类化合物的提取及清除羟自由基作用的研[J].食品科学，2007，28（1）：86-91.
[9]李守萍，张德财.浅谈浆果类树种在辽宁省果业发展中的地位[J].辽宁农业科学，2003（1：37-38.
[10]ZHAO Q,DUAN C Q,WANG J.Anthocyanins profile of grape berries of Vitis amurensis,its hybrids and their wines[J].Int J Mol Sci,2010,11(5):2212-2228.
[11]李亚东，刘海广，张志东，等.我国蓝莓产业现状和发展趋势[J].中国果树，2008，6（6）：67-69，71.
[12]刘芸，仇农学，杨玺玉.葡萄皮渣提取物总酚含量及体外抗氧化活性，抑菌活性[J].食品科学，2011，32（1）：5-9.
[13]RETAMALES J B,HANCOCK J F.Blueberries[M].Columns Design XML Ltd,Reading,UK.2018:33-34.
[14]KIM H K,CHEON B S,KIM Y H,et al.Effects of naturally occurring flavonoids on nitric oxide production in the macrophage cell line RAW 264.7 and their structure-activity relationships[J]. Biochem Pharmacol,1999,58(5):759-765.
[15]ORAK H H.Total antioxidant activities,phenolics,anthocyanins,polyphenoloxidase activities of selected red grape cultivars and their correlations[J].Sci Horticult,2007,111(3):235-241.
[16]WU X,PRIOR R L.Systematic identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States:fruits and berries[J].J Agr Food Chem,2005,53(7):2589-2599.
[17]郭晓倩，房子舒，刘凤娇，等.东北野生蓝莓花色苷组分分析及其抗氧化性比较[J].现代食品科技，2016，32（3）：313-320.
[18]陈纯.甘蔗皮多酚的提取、分离鉴定及抗氧化活性研究[D].杭州：浙江大学，2013.
[19]杨延峰，王远兴.基于超高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱的南丰蜜桔幼果化学成分分析及抗氧化活性研究[J].中国食品学报，2019，19（2）：273-280.
[20]HARBORNE J B,WILLIAMS C A.Advances in flavonoid research since 1992[J].Phytochem,2000,55(6):481-504.
[21]WINKEL S B.Flavonoid biosynthesis.A colorful model for genetics,biochemistry,cell biology,and biotechnology[J]. Plant Physiol,2001,126(2):485-493.
[22]冷吉燕，张婧，邵明柏.蓝莓花色苷的研究进展[J].中国老年学杂志，2011，31（17）：3419-3423.
[23]张美娇，田密霞，韦艳双.蓝莓果实花色苷成分组成鉴定及分析[J].保鲜与加工，2017，17（3）：107-110.
[24]胡济美，籍保平，周峰，等.大兴安岭笃斯越橘花色苷成分鉴定研究[J].食品科学，2009，30（10）：239-241.
[25]SRIVASTAVA A,AKOH CC,FISCHER J,et al.Effect of anthocyanins fractions from selected cultivars of Georgia-grown blueberries on apoptosis and phase II enzymes[J].J Agr Food Chem,2007,55(8):3180-3185.
[26]李亚东，孟凡丽，郑毅男，等.不同基因型越橘果实中4 种花色苷含量的研究[J].园艺学报，2004，31（3）：367-368.
[27]MAZZA G,FRANCIS F J.Anthocyanins in grapes and grape products[J].Crit Rev Food Sci Nutr,1995,35(4):341-371.
[28]DOWNEY M O,HARVEY J S,ROBINSON S P.The effect of bunch shading on berry development and flavonoid accumulation in Shiraz grapes[J].Aust J Grape Wine Res,2004,10(1):55-73.
[29]ARAJI S,GRAMMER TA,GERTZEN R,et al.Novel roles for the polyphenol oxidase enzyme in secondary metabolism and the regulation of cell death in walnut[J].Plant Physiol,2014,164(3):1191-1203.
[30]周向军，杨金龙，路宛如.莴笋多酚氧化酶，过氧化物酶的特性及抑制作用研究[J].食品工业科技，2015，36（5）：166-170.
[31]李仲叶，韩豪，江海，等.花色苷抗氧化活性的研究现状及展望[J].食品工业，2019，40（8）：238-243.
[32]FÁTIMA L S,SONIA P T,JULIÁN R G,et al.Identification of anthocyanin pigments in strawberry(cv Camarosa)by LC using DAD and ESIMS detection[J].Eur Food Res Technol,2002,214(3):248-253.