酱香型白酒是我国主要白酒香型之一，属大曲酒类，有酱香突出、幽雅细腻、酒体醇厚、回味悠长、空杯留香持久等典型特征[1]。曲乃酒之骨，大曲是中国白酒固态发酵的典型代表[2]，是白酒酿造生产中的糖化、发酵和生香剂，其品质对曲酒的出酒率和酒质都有极大的影响[3-4]。高温大曲在发酵过程中，含量最高的是细菌，而细菌中最多的是芽孢杆菌[5-8]。以茅台为代表的酱香型白酒经过长期的极端高温训化促成了酿酒微生态中耐高温微生物的富集，进而赋予了茅台酒独特的风格和完美的品质[9]。四甲基吡嗪又名川芎嗪，天然存在于大豆食品、咖啡、乳制品中，具有一种特别的香味，在食品工业中广泛用作调味剂、香味剂[10]。研究表明四甲基吡嗪具有扩张血管、改善微循环及抑制血小板集聚等作用，是白酒的健康因子之一，也是中国白酒的风味物质之一[11-12]，在酱香、芝麻香等采用高温曲发酵的白酒中普遍存在[13]，说明制曲过程中的热处理工艺与白酒中四甲基吡嗪含量存在一定关联性。罗惠波等[14]率先开展了热处理大曲对酿酒影响的实验，发现热处理大曲可丰富白酒的风味成分、提升白酒的质量，但该实验为实验室模拟数据，未在酿酒生产中尝试。因此，本实验以高温大曲为切入点，研究将高温工艺处理后的强化大曲应用在酱香型白酒实际生产中，探究应用热处理大曲进行酱香型白酒发酵的规律，对于提高白酒中四甲基吡嗪含量，赋予白酒养生保健价值，提升白酒风味和品质，指导酿酒一线生产有一定参考意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
两种大曲：常规曲是以小麦为原料，加入一定量的母曲（母曲是上一批次储存成熟后的粉碎的大曲），采用生料制曲，经过压制成砖形坯、摊晾、入仓发酵、翻曲、储存等传统工艺发酵生成的。加热强化大曲与常规曲生产不同的是母曲在加入之前，先在65 ℃的条件下加热5 h，然后密封冷却后添加在小麦中制作大曲，其他生产工艺与常规曲一致。以上两种酱香大曲由某酒厂制曲车间制得，均为存放半年后的成品曲。
糟醅：某酒厂实验车间第四轮次发酵白酒生产中，采用6点取样法，取不同位置的6等份糟醅样品混合均匀为1个样本，保留600 g，以相同的方式同步取1个平行样，共2个样本。每次取样需用专用样品袋密封，编上取样时间及地点，取样完成后样品需冷藏。具体样品名称及相应取样要求如下。堆积前：每个窖池取中层（第13或14甑）的糟醅，糟醅蒸完酒加曲拌匀后取样。入池糟：堆积完成后，进行移堆破位，糟醅在下窖池时取样，取样需要均匀覆盖上、中、下三层的糟醅。出池糟：分别取中层（第13或14甑）糟醅。馏酒后：每个窖池取中层（第13或14甑）的糟醅，糟醅蒸完酒加曲拌匀后取样
酒样：为按照生产标准掐头去尾后的混合大宗酒样。试剂：本实验中所用化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260 高效液相色谱仪、7890A自动进样气相色谱仪、Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）色谱柱：安捷伦科技有限公司；TW-200W 型可控温电炉：成都川西行工贸有限公司；PHS-3C型电位计：杭州奥力龙仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 测定方法
糟醅理化分析：水分、还原糖、淀粉分析检测均参考文献[15]的方法，酸度参考杜亚飞等[16]的方法。
氨含量检测：取大曲样品5 g，加入50 mL质量浓度为0.2 g/mL的氯化钠溶液，塞上盖子，超声振荡10 min，滤纸过滤。然后取上清液0.8 mL于50 mL容量瓶中，蒸馏水定容，然后先加入1 mL的酒石酸钾钠溶液，后加入1 mL的纳氏试剂，摇匀，静置10 min后，用紫外分光光度计在波长390 nm处测吸光度值，用氯化铵标准曲线回归方程计算样品中氨含量。
四甲基吡嗪、乙偶姻检测：前处理方法参考文献[17]，均采用高效液相色谱法，采用Agilent 1260高效液相色谱仪（配安捷伦Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）色谱柱，自动进样器、紫外检测器）。四甲基吡嗪检测条件为流动相比例为甲醇∶水（加0.05%三氟乙酸）=7∶3，柱温30 ℃，检测波长278 nm，流动相流速为1 mL/min。乙偶姻检测条件为流动相比例为甲醇∶水（加0.05%三氟乙酸）=3∶7（V/V），柱温30 ℃，检测波长278 nm，流动相流速0.8 mL/min。根据样品指标含量范围配制相应的标准溶液进样检测绘制标准曲线，样品四甲基吡嗪、乙偶姻含量可根据标准曲线的线性回归方程求得。
酒样风味物质检测：参照参考文献[18-19]，采用毛细管气相色谱法。酒体感官质量评价由酒体中心按生产感官规范由专业人员进行感官评价，为保证感官评价公正性，所有酒样感官评价均采用盲评方式得出。
1.3.2 生产实验方法
将前期制成的两种实验用曲分别单独粉碎，单独存放，做到曲药之间不交叉。实验分为实验组和对照组，实验组为1个窖池，对应的大曲为加热强化大曲组，对照组为1个窖池，所用大曲为平常生产使用的常规曲组。实验选取窖池，要求窖池特点、结构、大小相同，环境相似。酿酒生产实验时须做到同时开窖、同时蒸馏取酒、同时出甑、同时加曲、同时起堆、添加曲药量相同，统一操作、统一标准，按感官标准下窖操作，尽可能保证整个实验过程中大曲的种类不同是唯一变量，排除其他因素的影响，其余工艺控制参数根据酿酒作业指导书要求执行。
1.3.3 堆积、发酵过程温度记录
堆积过程中温度的检测：取糖化堆距离地面（90±4）cm，深度（20±3）cm，选择3个位置插入温度计测量温度，同时选择1个顶部深度（20±3）cm，记录4个不同位置的温度，堆积过程每隔12 h测量记录一次温度，最终通过取4个不同位置温度的算术平均值为代表糟醅堆积的温度。
发酵过程中温度记录：堆积过程每隔24 h测量记录一次温度，由于窖池较大且不同位置情况不同，故在6个固定的不同位置放置温度计检测发酵过程中升温情况，取同一时刻6个点位所测得温度的算术平均值为来反映发酵过程中该时间点窖池的温度情况。
2 结果与分析
2.1 糖化堆积温度变化
图1 堆积过程中温度的变化
Fig.1 Change of temperature during the stacking process
由图1可知，在堆积过程中温度先有一个明显的下降和趋于平稳的状态，这是由于高温大曲的主要微生物区系是细菌，前期微生物繁殖存在一个芽孢萌发和微生物生长的迟缓期，0～2 d时为微生物芽孢萌发期，细胞呼吸作用较弱，且微生物数量较少，故温度不仅没有上升反而存在下降的情况。2～6 d时温度处于逐渐微微上升的过程，此时微生物处于迟缓期，这个过程中主要是新萌发的微生物适应新的环境，同时合成大量酶类，呼吸作用开始呈现逐渐增强的过程，为对数期快速增殖做准备。6～10 d时两组实验均出现温度快速升高的过程，此时堆积环境中微生物处于对数期，大量代谢产能导致微生物群落趋于稳定，入池前两组实验入池温度差异较小。堆积全过程温度差异最大的阶段出现在6～10 d时，对数期呈现的升温不同也侧面反映了两者微生物群落上的差异性较大。
2.2 发酵过程中温度变化
图2 发酵过程中温度的变化
Fig.2 Change of temperature during the fermentation process
发酵温度直接影响糟醅理化指标进而影响白酒品质。由图2可知，糟醅堆积阶段两组实验的温度差异特点在入池发酵过程中得到更大的体现，即在发酵全过程中均呈现常规曲组温度高于加热强化大曲组的趋势。整体上来看在入池发酵阶段总体上两者变化趋势一致，均是在入池前5 d温度上升，说明在入池前5 d内窖池内氧气供给较充足，微生物仍然处于增殖的过程，5 d后随着氧气消耗，窖池内微生物开始由有氧增殖向无氧发酵产酒进行，后期也存在温度上升的趋势，推测这和随着产酒过程中窖池内微生物发生改变后的群落更替有关，末期两者温度开始趋向一致。常规曲在发酵12 d时出现了明显的升温异常，相对来说加热强化大曲组在整个发酵过程温度变化更加稳定。堆积和发酵过程中的微生物代谢活动导致的升温差异进一步说明了两者在微生物群落结构上的显著差异性，推测这种微生物群落结构的差异性是由于高温强化大曲生产时对母曲的长时间高温处理导致部分代谢产热较强的微生物失活，强化大曲微生物群落中能形成芽孢的耐热强且代谢产热低的细菌占比更大有一定关联性。
2.3 酿酒过程中主要理化指标对比分析
酸度、水分、淀粉、还原糖是白酒生产中重要的指标，可直接反映酿酒过程的情况和微生物群落的差异，进而影响白酒品质。
图3 酿酒过程中酸度，水分、还原糖、淀粉含量的动态变化
Fig.3 Dynamic changes of acidity,moisture,reducing sugar and starch contents during the Baijiu-making process
由图3可知，两组实验酸度在堆积过程中呈现明显降低的趋势，这和堆积过程中处于开放的有氧的环境不利于厌氧的产酸细菌繁殖有一定关系，两组实验酸度在堆积过程中均处于相似水平，但随着堆积结束入池发酵的进行，糟醅的酸度呈现显著上升趋势，这是由于整个发酵过程处于密封的厌氧发酵环境中，厌氧或者兼性厌氧的产酸细菌大量繁殖，导致糟醅酸度增加，且从图3中可以明显看出常规曲组的酸度显著高于加热强化大曲组实验，这和两种大曲中的微生物群落有着密切联系。馏酒前后两组实验均呈现一定降低趋势，说明高温馏酒过程中有机酸挥发较多。水分含量在堆积和发酵过程中两组均呈现出增加的趋势，常规曲组的水分均略高于实验组，说明在微生物群落上实验组与常规曲组存在较大差异。还原糖与淀粉方面两者变化均呈现较大的一致性，均呈现随着发酵的进行不断降低的趋势，但本轮次堆积过程中还原糖无明显增加，在后续轮次追踪实验中值得进一步观察。值得注意的是，由于馏酒后糟醅水分降低较多的缘故，故还原糖和淀粉含量测定值呈现略微上升。从整个酿造过程可以看出实验组与对照组在酸度、水分、还原糖、淀粉四种主要理化指标上呈现相同的变化趋势，但两组之间又存在一定差异，总体上反映了两种大曲对微生物群落影响各有不同，具体机制有待进一步研究。
2.4 酿酒过程中乙偶姻、氨、四甲基吡嗪形成对比分析
图4 酿酒过程中乙偶姻（a）、氨含量（b）及四甲基吡嗪含量（c）的变化
Fig.4 Change of acetoin (a),ammonia (b) and tetramethylpyrazine (c)contents during the Baijiu-making process
两步法形成四甲基吡嗪理论中，乙偶姻是由微生物代谢产生，乙偶姻通过与氨发生热力学反应合成四甲基吡嗪[20]，故乙偶姻和氨的含量对于四甲基吡嗪形成至关重要。由图4A可知，在酿酒过程中加热强化大曲组的乙偶姻水平均高于常规曲组实验，且在堆积过程中加热强化组呈现上升趋势，常规曲组乙偶姻含量无变化，说明在微生物代谢产乙偶姻方面加热强化大曲组优势显著。同时可以发现微生物产生乙偶姻主要在入池发酵阶段，说明乙偶姻产生与厌氧环境密切相关。由图4B可知，氨的产生主要来自于高温堆积阶段，两组差异不大，但常规曲组在发酵后高于加热强化大曲组。由图4C可知，四甲基吡嗪呈现和乙偶姻变化大致一致的趋势，四甲基吡嗪产生也主要来自于窖池发酵阶段，说明与厌氧环境有一定关联性。两组实验四甲基吡嗪差异主要体现在堆积阶段，可以看出加热强化大曲组四甲基吡嗪含量有明显的提升，但常规曲组四甲基吡嗪含量则无变化，这与乙偶姻的差异呈现一致性，说明从形成四甲基吡嗪两步法的微生物角度加热强化大曲优势显著，推测这与加热处理后嗜热细菌具有群落优势有一定关联性。但两组实验在出池后四甲基吡嗪则差异不大，这是由于在乙偶姻和氨方面两者交替领先，因而在合成四甲基吡嗪上趋于一致。值得注意的是，虽然本次酿酒生产实验一定程度上验证了两步法产生四甲基吡嗪的机制，加热强化大曲也的确可以从微生物角度提升乙偶姻含量和四甲基吡嗪含量，但可以看出四甲基吡嗪含量与乙偶姻和氨含量值之间差异达3个数量级，合成反应转化率非常低。且入池发酵后实验组与对照组的四甲基吡嗪含量趋于一致，说明提升四甲基吡嗪含量从微生物角度入手是不够的，还需要从提升四甲基吡嗪合成的转化效率上开展研究。
2.5 酒样分析对比
2.5.1 酒样风味物质对比
两组实验大宗酒样经过气相色谱检测，一共检测到69种风味物质，为了方便分析，将69种风味物质经过分类计算简化得表1。如表所示，一共在酒样中检测到的69种风味物质可分为7大类风味物质，其中含量从高到低依次为酯类、酸类、醇类、醛类、酮类、酚类、吡嗪类，其中酯类、酸类、醇类、醛类四类香味物质占据风味物质总含量的95%以上。并且酯类含量最高，约占总风味物质的60%左右，酯类中乳酸乙酯和乙酸乙酯占比较大，乙乳比的平衡对于酱香型白酒的风味尤其重要，赋予了酱香型白酒优雅柔的特点，总体来说常规曲组在乳酸乙酯水平上显著高于加热强化大曲组，而乙酸乙酯方面加热强化大曲组高于常规曲组，故总体来说乙乳比平衡上加热强化大曲组优于常规曲组。酸类呈现常规曲组高于加热强化大曲组的现象，这与检测发酵过程中的有机酸含量呈现一致，含量较高的酸是乙酸，常规曲组含量也显著高于强化大曲组，推测这与发酵过程中加热强化大曲组的发酵温度显著低于常规曲组有较大关系。酱香型白酒的标志性风味物质研究结果表明，吡嗪类可能是主要风味物质之一，两组酒样中吡嗪类物质均偏低，但加热强化大曲组四甲基吡嗪含量显著高于常规曲组，此规律与出池糟中两者乙偶姻含量趋势一致，推测这是由于乙偶姻和氨在馏酒过程的高温环境下，合成了四甲基吡嗪，且合成量与乙偶姻含量正相关。
表1 酒样风味物质对比
Table 1 Comparison of flavor substances in Baijiu samples mg/100 mL
续表
2.5.2 酒样感官评价对比
酒样理化指标的差异在酒样感官分析中更得到了直观体现，具体感官评价见表2。由表2可知，总体来看加热强化大曲组在酱香风味和酒体醇厚方面显著优于常规曲组，四甲基吡嗪具有赋予白酒焦香气味的功效，推测两组实验酒样关于酱香风味评价上的差异正是由于两者在四甲基吡嗪上的差异导致的。结合糟醅理化、发酵温度，和酒样风味三方面来看，一方面是反映了两组实验微生物群落结构的差异性，另外一方面正是由于在发酵中的糟醅理化和发酵温度差异性进一步导致了加热强化大曲组在控制酒体酸含量，平衡乙酸乙酯和乳酸乙酯比例方面更优，故反映在感官体验上则是得到了酒体醇厚，香气馥郁的评价。故加热强化大曲在提升酒质方面效果显著，总体评价为加热强化大曲组优于常规曲组。
表2 酒样的感官评价
Table 2 Sensory evaluation of Baijiu samples
3 结论
通过加热强化大曲组和常规曲组的理化分析对比，表明加热强化大曲组在平衡酸度和控制发酵过程水分方面均显著优于常规曲组。糖化堆积过程温度两组差异不大，但在入池发酵阶段则呈现全过程常规曲温度均高于加热强化大曲的趋势。乙偶姻含量在整个酿造过程中呈现加热强化大曲优于常规曲的趋势，说明在酿造过程中强化大曲从微生物群落角度提升四甲基吡嗪含量效果显著，但另外一方面由于整个酿造过程中两组实验氨含量高低与乙偶姻含量高低呈现相反趋势，故反映到糟醅中合成的四甲基吡嗪含量差异不明显。大宗酒中四甲基吡嗪差异较大，常规曲组为未检出，加热强化大曲组四甲基吡嗪含量为0.13 mg/100 mL。但糟醅中四甲基吡嗪含量并没有表现出明显差异，说明提升白酒中四甲基吡嗪含量不仅仅要考虑从微生物角度出发提高乙偶姻含量，研究提高乙偶姻和氨合成四甲基吡嗪的转化效率以及馏酒过程中四甲基吡嗪的合成和提取也是至关重要的。在白酒酒质方面则与前面的糟醅理化及温度变化呈现一定的关联性，加热强化大曲组在控制酒体酸含量，平衡乙酸乙酯和乳酸乙酯比例显著优于常规曲组。四甲基甲基吡嗪含量方面加热强化大曲组也显著优于常规曲组，感官上加热强化大曲组则是得到了酒体醇厚，香气馥郁的评价。综合酿造过程和白酒感官理化，总体评价为加热强化大曲组优于常规曲组，加热强化大曲对于提升酱香型白酒品质有着良好的效果。
[1]杨国华，邱树毅，黄永光.酱香白酒生产中产香微生物研究[J].中国酿造，2011，30（4）：24-27.
[2]HAN X L,JIA S R,ZHANG W J.Analysis of Daqu produced in different seasons[J]. J I Brewing,2016,122(3):397-402.
[3]ZHENG X W,YAN Z,NOUT M J,et al.Microbiota dynamics related to environmental conditions during the fermentative production of Fen-Daqu,a Chinese industrial fermentation starter[J]. Int J Food Microbiol,2014,182-183(28):57-62.
[4]ZHANG W X,WU ZY,ZHANG Q S,et al.Combination of newly developed high quality Fuqu with traditional Daqu for Luzhou-flavor liquor brewing[J].World J Microb Biot,2009,25(10):1721-1726.
[5]李斌，闫志鹏，李慧星，等.基于高通量测序技术的浓香型和芝麻香型白酒酒曲细菌群落结构分析[J].中国酿造，2018，37（8）：148-152.
[6]ZHU W,YAO N,YAN X.The incidence and distribution of ochratoxin A in Daqu,a Chinese traditional fermentation starter[J].Food Control,2017,78:222-229.
[7]WANG X D,BAN S D,HU B D,et al.Bacterial diversity of Moutaiflavour Daqu based on high-throughput sequencing method[J].I Brew Dist,2017,123:138-143.
[8]ZHANG H,ZHANG X,ZHAO J,et al.Analysis of the microbial communities of three kinds of Fen-Daqu by PLFAs[J].J I Brewing,2016,122(1):34-41.
[9]赵群丽.酱香大曲中酿酒微生物的筛选及发酵工艺研究[D].贵阳：贵州大学，2016.
[10]刘苑皓，赵兴秀，舒梨，等.酱香型窖醅中产酯细菌的分离及鉴定[J].中国酿造，2019，38（6）：74-78.
[11]丁海龙，敖灵，邓波，等.中国白酒微量健康成分分析[J].中国酿造，2018，37（2）：11-14.
[12]FAN W L,XU Y,ZHANG Y H.Characterization of pyrazines in some Chinese liquors and their approximate concentrations[J]. J Agr Food Chem,2007,55(24):9956-9962.
[13]高传强.芝麻香型白酒风味物质及其生物活性研究[D].武汉：湖北工业大学，2017.
[14]周平，罗惠波，黄丹，等.不同热处理大曲对白酒酿造的影响研究[J].食品科技，2016，41（8）：39-44.
[15]中华人民共和国轻工行业.QB/T 4257—2011《酿酒大曲通用分析方法》[S].北京：中国标准出版社，2011.
[16]杜亚飞，蒋英丽，何世兴，等.大曲中总酸和氨基酸态氮的连续滴定[J].中国酿造，2014，33（6）：132-134.
[17]郭维伟.地衣芽孢杆菌发酵四甲基吡嗪条件研究[D].济南：齐鲁工业大学，2017.
[18]陈梦圆，刘学彬，汪平，等.产酯香功能菌对酱香型酒醅的影响[J].食品科学，2018，39（10）：199-205.
[19]蔡雪梅，吴联海，陈梦圆，等.酱香型白酒酒糟中生香酵母的筛选及鉴定[J].中国酿造，2017，36（7）：42-47.
[20]吴建峰.白酒中四甲基吡嗪全程代谢机理研究[D].无锡：江南大学，2013.