紫甘蓝（Brassica oleracea var.capitata rubra），又名紫包菜，属十字花科植物，在我国广泛种植，是餐桌上的美食佳肴[1-2]。大量研究表明[3-5]，紫甘蓝含有丰富的维生素和花青素（主要成分为矢车菊苷），具有明显的抑菌和抗氧化功效[6-9]。同时具有抗炎、预防心血管疾病、保肝等多种生理功能[10]，广泛用于食品、药品、化妆品等领域。紫甘蓝中半胱氨酸和优质蛋白对脂肪肝、酒精肝及肝脏功能障碍等疾病具有较好的防治效果[11]。
益生菌是一类定植于人体肠道、生殖系统内对宿主有益的微生物，可以产生对人体有益功效。目前，益生菌主要可分成乳杆菌类、双歧杆菌属、革兰阳性球菌等[12]。研究表明，益生菌能够提高机体的抗氧化能力，具有良好的降血脂功效，对缓解和治疗肠易激综合症以及改善肠道微生物菌群有积极作用[13-14]。
酸乳在乳制品中占主导地位，目前，发酵酸乳已成为乳制品发展趋势之一，除营养成分便于人体吸收，还具有一定的助消化、抗氧化、抗菌、增强免疫力的功能作用。目前，为满足消费者对口感的需求，市场上不断涌现不同水果口味的酸乳，但鲜见添加蔬菜的乳制品。本实验以干燥、研磨等处理后的紫甘蓝粉和脱脂牛乳为原料，接种德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）进行益生菌发酵，利用单因素试验以及Box-Behnken试验优化发酵条件确定最佳接种量、发酵温度和时间，最后与新鲜葡萄汁复配，进而改善复合酸乳的口感、色泽等，制成一款风味口感较佳的新型乳制品。此外，测定分析紫甘蓝复合酸乳的多酚含量及其抗氧化性，并对产品感官、理化及微生物指标进行测定。将紫甘蓝与牛乳结合进行乳酸发酵，不仅可为人们日常生活增加一种风味可口的乳制品，而且为紫甘蓝乳制品的相关研究与工业化生产提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
紫甘蓝、玫瑰香葡萄（糖含量15.2%～16.4%；酸含量0.48%～0.56%）、脱脂牛乳（蛋白质4%～6%；碳水化合物1%～2%）、蔗糖（食品级）：市售；德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）CICC 20253，中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 化学试剂
MRS培养基：北京博星生物科技有限公司；无水乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；酚酞：沈阳思诺达生物科技有限公司；没食子酸（分析纯）：成都埃法科技有限公司；福林酚（分析纯）：上海源叶生物有限公司；碳酸钠（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；维生素C（vitamin C，VC）（分析纯）：南京奥多福尼生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
JYL-C010打浆机：九阳股份有限公司；LQ-A30002电子天平：瑞安市乐祺贸易有限公司；DHP-927电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；TG16B型高速台式离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：北京天林恒泰科技有限公司；LDZX-30KB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；JA1003A电子天平：上海精天电子仪器厂；BHS-1型数显恒温水浴锅：福州泰美试验仪器有限公司；PSSJ-4V型精密pH计：上海精密科学仪器公司；WFJ粉碎机：常州市磐丰干燥设备有限公司；FD-1A-50型真空冷冻干燥机：江苏天翎仪器有限公司；MB-580型全自动酶标分析仪：济南欧莱博科学仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料加工工艺流程及操作要点
操作要点：
（1）原料预处理
紫甘蓝粉的制备：选用成熟度适中、表皮无机械损伤的紫甘蓝，因其具有较大蔬菜气味，清洗后切分块状，利用真空冷冻干燥机干燥处理（-80 ℃处理4～6 h），在保证其营养成分、抗氧化花青素等成分的结构和活性不被破坏的同时，很大程度上去除了蔬菜的生苦气味，干燥后利用粉碎机将紫甘蓝粉碎成粉，然后过40目筛后备用。
新鲜葡萄汁的制备：选用表皮与果肉色泽良好、成熟度适中、甜度较高的玫瑰香葡萄，洗净后去皮和去籽处理，然后用榨汁机榨汁后通过65～70 ℃、20～30 min巴氏灭菌对其处理，处理后4 ℃保存备用。
（2）原料的混合
以紫甘蓝粉与牛乳以1∶100（g∶mL）的比例混合均匀后，加入质量分数为8%～10%蔗糖，通过70 ℃、30 min巴氏灭菌，并冷却至40 ℃。
（3）发酵
以德氏乳杆菌保加利亚亚种菌为发酵菌剂，取-80 ℃冻存的乳杆菌，以1%的接种量接入10 mL的MRS液体培养基中，于37 ℃摇床培养箱中以220 r/min培养13 h进行活化，活化后按接种量为5%接种到紫甘蓝牛乳混合液中，在发酵温度为30 ℃的条件下发酵至总酸含量保持不变时，终止发酵。
（4）调配、均质
发酵酸乳在无菌环境下加入已灭菌的新鲜葡萄汁后均质（230 MPa、55 ℃），制得一款淡蓝色、口感细腻、风味独特的紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料。
1.3.2 发酵工艺条件优化单因素试验
为使产品口感更加柔和，风味更加丰富，对其发酵条件进行优化。以发酵酸乳总酸度为评价指标，分别考察发酵过程中接种量、发酵温度和发酵时间等因素对酸度的影响。考察德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、发酵时间（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）对发酵酸乳总酸度的影响。
1.3.3 发酵工艺条件优化响应面试验
根据单因素试验结果，选择接种量（U1）、发酵温度（U2）、发酵时间（U3）为影响因素，以发酵酸乳总酸度（Y）为评价指标[15]，设计3因素3水平响应面试验。响应面试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization
1.3.4 酸乳调配工艺优化
本实验以经过脱味处理的紫甘蓝作为发酵原料，发酵后，在带有蔬菜清香味的同时，微微带有蔬菜的生苦味道。在保证酸乳的安全性、营养丰富的原则上，实验利用新鲜葡萄汁作为调味剂。在响应面实验结果最优样本中，分别按添加量为15%、20%、25%、30%、35%的新鲜葡萄汁进行调配、均质，以感官评价为评价标准对紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料进行综合评价。
1.3.5 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料多酚含量测定
没食子酸标准曲线的绘制[16]：精确吸取质量浓度为100 μg/mL没食子酸标准溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.6 mL，加入0.8 mL福林酚试剂，避光反应3～5 min后加入10%碳酸钠1.5 mL终止反应，加水定容至10 mL，避光反应2 h，于波长765 nm处测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x，μg/mL）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，标准曲线回归方程为y=0.015x+0.039，相关系数R2为0.999 5。按照没食子酸标准曲线回归方程计算紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料样品中多酚含量，结果以mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/mL计。
1.3.6 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料抗氧化活性分析
（1）铁离子还原力[17]
维生素C标准曲线的绘制：将1 mg/mL VC标准溶液稀释成0、5 mg/100 mL、10 mg/100 mL、15 mg/100 mL、20 mg/100mL、25mg/100mL，在96孔板的每个检测孔中加入180μL铁离子还原力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）工作液后加入5 μL各质量浓度标准液，混匀后37 ℃孵育3 min，于波长593 nm处测定吸光度值。用VC溶液为标准对照，测定不同质量浓度VC反应所得吸光度值，以VC质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程为y=1.054 4x+0.132（相关系数R2=0.999 6）。样品FRAP用VC抗氧化当量VCEAC表示。FRAP值越大，表明其抗氧化性能力越强。
（2）DPPH自由基清除率的测定[18]
取1 mL复合酸乳与1 mL 0.1 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液混合反应20 min后，500 r/min 离心10 min，测定上清液在517 nm处的吸光度值记为Ai，同时用乙醇作空白对照，吸光度值记为Ac，以及1 mL样品水溶液和1 mL无水乙醇混匀按上述方法测定吸光值记为Aj。DPPH自由基清除率计算公式如下：
1.3.7 产品品质分析
（1）感官评定[19]
选固定的15 位有经验的评价人组成评审小组，从色泽、组织状态、气味、滋味和对发酵乳进行综合评分，满分100分，对15 组数据求平均值并进行统计分析。感官评分标准见表2。
表2 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standard of purple cabbage-grape juice compound milk beverage
（2）理化指标
脂肪测定依据GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中碱水解法；非脂乳固体含量测定依据GB 5413.39—2010《食品安全国家标准乳和乳制品中非脂乳固体的测定》；蛋白质测定按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法；酸度测定按照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》中酚酞指示剂法。铅、铬、汞、砷等重金属含量依据GB 2762—2017《食品中污染物限量》测定。
（3）微生物测定
乳酸菌数测定按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》；大肠杆菌按照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》中平板计数法；致病菌如金黄色葡萄球菌检验按照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》；沙门氏菌测定按照GB 4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺条件优化单因素试验结果
2.1.1 接种量对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响
在37 ℃发酵18 h条件下，接种量设置为1%、2%、3%、4%、5%，测定各组酸度，结果见图1。由图1可知，随着菌株接种量在1%～5%范围内的增高，紫甘蓝发酵乳饮料的酸度先逐渐增加；菌株接种量＞4%后酸度平缓。因此，最适接种量为4%。
图1 接种量对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响
Fig.1 Effect of inoculum on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage
2.1.2 发酵温度对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响
在接种量为3%，发酵时间为18 h条件下，发酵温度对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响，见图2。由图2可知，当发酵温度在33～37 ℃之间时，随发酵温度升高，乳饮料的酸度明显增大，其原因可能是在温度未达到最适温度时，随发酵温度的增大，较高温度更适宜菌的生长，提高菌的产酸能力；当发酵温度为37 ℃时，发酵后乳饮料酸度最大，为96°T；当发酵温度超过37 ℃时，发酵后乳饮料酸度降低，推测主要原因是温度升高，超过了菌的最适温度范围值，菌的活性下降，产酸等物质的能力下降，降低了发酵后酸乳的风味口感。因此，最适发酵温度为37 ℃。
图2 发酵温度对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage
2.1.3 发酵时间对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响
在接种量为3%，发酵温度为37 ℃条件下，酸度随发酵时间变化结果见图3。由图3可知，发酵后乳饮料的酸度随发酵时间在6～12 h范围内的增长而增大，且在发酵12 h后，酸度趋于平缓，推测菌株发酵12 h，适宜菌株生长的营养物质基本耗尽，产酸能力微弱。因此，最适发酵时间为12 h。
图3 发酵时间对紫甘蓝发酵乳饮料酸度的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage
2.2 发酵工艺条件优化响应面试验结果
采用Design-Expert 8.0.6软件设计Box-Behnken 试验，进一步以紫甘蓝发酵乳饮料的酸度（Y）为响应值，优化接种量（U1）、发酵温度（U2）及发酵时间（U3），获得最佳发酵条件。Box-Behnken 试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
采用Design-Expert 8.0.6对表3试验结果进行回归分析，得到的多元二次回归方程如下所示：
回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值越小，则相应变量的显著程度越高[20]。由表4可知，模型的P值=0.000 2＜0.01，差异极显著，具有统计学意义，失拟项P值=0.441 7，差异不显著，说明所选模型与试验拟合度较好，可用该模型对试验结果进行分析。一次项U1、U2、U3、交互项U1U3、二次项U22、U32对响应值的影响极显著（P＜0.01）。试验因子对响应值不是简单的线性关系，二次项和交互项与响应值都有很大的关系，说明方程的拟合是充分的，回归方程也是高度显著的，同时失拟项也进一步表明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，因此可以利用该回归方程确定最佳发酵工艺参数，接种量为5%、发酵温度为38.5 ℃、发酵时间11.9 h的条件下，酸度预测值可达105.5 °T。为方便实际操作，将最佳发酵工艺参数修正为：接种量5%、发酵温度39 ℃、发酵时间12 h，并在此条件下进行3次平行发酵试验，酸度实际值可达（104.8±0.3）°T，与预测值无显著性差异（P＞0.05）。
各因素交互作用对酸度影响的响应面及等高线见图4。由图4可知，当发酵温度一定时，随着接种量的增加，发酵乳饮料酸度值增大，但酸度值增大的幅度逐渐趋于平缓；当接种量一定时，随着发酵时间的延长，发酵乳饮料酸度值增大趋于平稳后，略有降低趋势；当发酵时间一定时，随着发酵温度的升高，发酵乳饮料酸度值先增大后减小，可表明发酵温度、接种量和发酵时间三个因素两两之间交互作用显著。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
图4 接种量、发酵温度与发酵时间交互作用对紫甘蓝发酵乳饮料酸度影响的响应面图
Fig.4 Response surface plots of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on acidity of fermented milk beverage of purple cabbage
2.3 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料感官评价结果
对响应面试验结果中最优样本加入不同比例葡萄汁调配后进行感官评分，结果如图5所示。由图5可知，在新鲜葡萄汁添加量15%～25%时，随葡萄汁添加量增加，紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料的感官评分增高，主要原因为葡萄汁具有水果清香，可掩盖紫甘蓝蔬菜的生苦气味，同时，葡萄汁富含较高比例的碳水化合物，与酸乳搭配可以提高酸乳的风味和滋味；在新鲜葡萄汁添加量为25%时，紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料的感官评分最高，为92分；在新鲜葡萄汁添加量＞25%之后，感官评分结果明显降低，主要原因是葡萄汁中的碳水化合物掩盖住酸乳的酸度，大大降低了口感。因此，葡萄汁的最适添加量为25%。
图5 葡萄汁添加量对紫甘蓝-葡萄汁乳饮料感官评分的影响
Fig.5 Effect of grape juice addition on sensory evaluation of purple cabbage-grape juice compound milk beverage
2.4 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料多酚含量及抗氧化能力分析
依据1.3.5方法测定紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料的多酚含量，并利用FRAP法和DPPH自由基清除法测定抗氧化能力，结果见表5。由表5可知，复合乳饮料中总多酚含量为（2.41±0.05）mgGAE/mL，FRAP值为（170.25±3.21）mgVCE/L，DPPH自由基清除率为（75.2±1.0）%。结果表明，紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料具有较好的抗氧化能力。
表5 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料多酚含量和抗氧化能力测定结果
Table 5 Results of polyphenol contents and antioxidant activity of purple cabbage-grape juice compound milk drink
2.5 紫甘蓝-葡萄汁复合乳饮料质量分析
2.5.1 感官评价
产品呈现紫甘蓝特有的淡紫色，质地细腻，口感顺滑，酸甜适中，无乳清析出，酸奶的芳香与葡萄和甘蓝的清香味结合呈现特殊的风味，无异味。
2.5.2 理化指标
非脂乳固体（8.1±0.3）g/100g；蛋白质（4.8±0.5）g/100 g；酸度（82.14±0.5）°T；铅≤0.05 mg/kg；铬≤0.3 mg/kg；总汞≤0.01 mg/kg；总砷≤0.1 mg/kg。均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》和GB 2762—2017《食品中污染物限量》要求。
2.5.3 微生物指标
乳酸菌数≥1×106CFU/mL；大肠杆菌数≤1CFU/100mL；致病菌未检出，均符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》要求。
3 结论
利用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株作为发酵剂，以紫甘蓝、脱脂牛乳作为混合发酵原料，通过单因素试验以及响应面试验设计确定了最佳发酵工艺：每100 mL牛乳中加入1%紫甘蓝粉，接种量为5%、发酵温度为39 ℃、发酵时间12 h；调配工艺：加入25%新鲜葡萄汁，此时发酵调配后的酸乳的酸度值为（82.14±0.5）°T，综合感官评价分值达到92分；其多酚含量为（2.41±0.05）mgGAE/mL，FRAP值及DPPH自由基清除率分别为（170.25±3.21）mgVCE/L、（75.2±1.0）%。最终得到一款呈紫色、质地均匀，口感细腻、爽口，具有蔬菜和水果特有的清香且具有较高抗氧化性得产品。
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