苹果醋含有丰富的有机酸[1]、氨基酸[2]、多酚类[3]、维生素[4]等物质，具有良好的营养、保健作用。有机酸是果醋酸味的主要来源，氨基酸能够丰富果醋的风味与营养[5]，酚类物质与苹果醋的营养价值密不可分，研究表明苹果醋中丰富的多酚类物质，既具有预防癌症、高血压、心脏病等作用，也可保护维生素C不被破坏从而使胆固醇含量降低[6]。
玫瑰水提物中含有丰富的玫瑰花色素和芳香类物质，玫瑰花色素是一种天然食用色素，包括没食子单宁类、鞣花单宁类、橡黄素、天然葵色素等[7]，花色素是药用价值很高的天然强效自由基清除剂，具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、预防和治疗心血管疾病、抑菌等多种药用功能[8-9]。
采用苹果醋、玫瑰水提物为主料制得的苹果玫瑰醋复合饮料，香气浓郁、颜色鲜艳，口感酸甜且有很高的营养价值。目前国内研究主要集中在单一果醋的研究开发方面，而对复合果醋饮料的营养保健功能研究较少。本实验分析检测苹果玫瑰醋复合饮料中的有机酸、游离氨基酸和基本营养素等物质成分，研究酚类物质含量及其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的能力，并与单一苹果醋饮料的抗氧化性能进行比较，旨在为苹果玫瑰醋饮料营养成分和抗氧化性能研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果：甘肃省静宁县；玫瑰：兰州市永登县苦水镇；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）CICC20056：中国微生物菌种保藏中心；蔗糖、浓缩苹果汁（可溶性固形物70%）（均为食品级）：市售。
亚铁氰化钾、硫酸锌、磷酸二氢钠、甲醇、磷酸、盐酸、异硫氰酸苯酯、氢氧化钠、柠檬酸、正丁醇、乙酸乙酯、邻苯三酚、Tris-HCl、硫酸亚铁、水杨酸、DPPH、乙醇等试剂（均为分析纯）：上海晶纯生化科技股份有限公司；乙酸、酒石酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸、没食子酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、儿茶酚、槲皮苷、芦丁等标准品（均为色谱纯）：北京北纳创联生物技术研究院。
1.2 仪器与设备
UV 2400紫外可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TGL-16 MC冷冻离心机：长沙维尔康湘鹰离心机有限公司；PAL-1数显糖度计：日本爱拓数显糖度计；HH-S4电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪：美国安捷伦仪器公司；Rigol L3000高效液相色谱仪：苏州普源精电科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 苹果玫瑰复合醋饮料制备工艺
1.3.2 操作要点
（1）饮料用苹果醋制备：选用新鲜完好无腐烂、病虫害的苹果，清洗榨汁，调整果汁可溶性固形物含量至14°Bx后，接种苹果汁总质量8%的活化果酒酵母，25 ℃酒精发酵7 d，糖度不再下降时，接种苹果汁总质量10%的巴氏醋杆菌，32 ℃醋酸发酵8 d，杀菌、陈酿后得到饮料用苹果醋，总酸含量≥4%。
（2）玫瑰提取液的制备：将玫瑰花蕾粉与水混合（玫瑰花蕾粉的质量和水的体积比为1∶40（g∶mL）），在80 ℃条件下提取30 min后过滤，将滤渣在85 ℃条件下再次提取30 min，将两次提取液混合，得到可溶性固形物含量＞2°Bx的玫瑰提取液。
（3）复合饮料的调配：饮料用苹果醋8 mL/100 mL，玫瑰提取液20 mL/100 mL，蔗糖7 g/100 mL，苹果浓缩汁6 g/100 mL。
（4）过滤、杀菌、灌装：采用硅藻土过滤，高温瞬时杀菌（103 ℃，处理2～3 min），瓶装、封口，即为成品。
1.3.3 样品处理将苹果玫瑰复合醋饮料经4 ℃、8 000 r/min 条件下离心10 min，取上清液保存用于测定。
1.3.4 有机酸含量的测定[5]
采用高效液相色谱法进行标品分析、样品测定。取10 mL醋液，加入106 g/L亚铁氰化钾溶液和300 g/L硫酸锌溶液各2 mL，摇匀后用超纯水定容至100 mL。静置30 min，移取上清液，用0.45 μm滤膜过滤弃去初滤液，取后续滤液供HPLC分析用。色谱条件：C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm），流动相：磷酸二氢钠、甲醇，用磷酸调节pH值为2.8，进样量10 μL，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，走样时间为20 min，紫外波长214 nm。
1.3.5 游离氨基酸的测定
参照陈蓉等[10]柱前衍生-高效液相色谱法测定苹果玫瑰醋中的17种氨基酸含量。以6 mol/L盐酸150 ℃水解1 h，以异硫氰酸苯酯为柱前衍生化试剂衍生后进样分析。采用Kromasil C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温43 ℃，流动相A为0.1 mol/L醋酸钠缓冲液（以醋酸调pH 6.5）∶乙腈（93∶7，V/V），流动相B为乙腈∶水（4∶1，V/V），梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm。
1.3.6 基本营养及能量分析
能量的测定按GB/T 28050—2011《食品安全国家标准预包装食品营养标签通则》规定的方法；钠的测定按GB/T 5009.91—2017《食品中钾、钠的测定》规定的方法；脂肪的测定按GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》规定的方法；蛋白质的测定按GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》规定的方法；水分：按GB/T 5009.3—2016《食品中水分的测定》规定的方法；灰分的测定按GB/T 5009.4—2016《食品中灰分的测定》规定的方法；膳食纤维的测定按GB/T 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》规定的方法。
1.3.7 酚类物质测定[3]
标准溶液制备：分别称取没食子酸等标准品2.5 mg，配制成4 500 mg/L母液，再配制成在5～100 mg/L范围内的7个不同质量浓度梯度的7种单体酚的混合标准溶液，-30 ℃保存备用。
样品前处理：取30 mL苹果玫瑰醋复合饮料样品，用NaOH调节pH至8.0，正丁醇等量萃取3次，合并有机相，水相用柠檬酸调节pH至2.0，同样乙酸乙酯萃取3次，合并所有有机相，氮吹，残渣溶于3 mL色谱甲醇中，测定样品前经0.45μm微孔滤膜过滤。置于-20℃避光保存，待液相分析用。
色谱条件：色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱（250 mm×4.6mm，5μm）；流速0.8mL/min；柱温30℃。检测波长280nm。梯度洗脱：流动相A，水∶乙酸（98∶2，V/V）；流动相B，乙腈。
1.3.8 抗氧化活性研究
（1）DPPH自由基清除率的测定[11]
配制2×10-4 mol/L的DPPH溶液。取样液2 mL及等体积2×10-4 mol/L DPPH溶液加入同一具塞试管中，摇匀，30 min后用无水乙醇作参比测定其在波长517 nm处的吸光度值Ai。同时测定2×10-4 mol/LDPPH溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度值Ac，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度值Aj。根据下列公式计算：
式中：Ac：DPPH与溶剂混合液的吸光度值；Ai：DPPH与样液反应后的吸光度值；Aj：样液与溶剂混合液的吸光度值。
（2）超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定[12]
采用邻苯三酚自氧化法。向各试管中加3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，再分别加1 mL的待测液，用pH 8.30的Tris-HCl缓冲液定容至9 mL，测定波长325 nm处的吸光度值，每隔30 s测一次，直到反应启动后的第6分钟，把所得的数据以时间为横坐标，A325nm值为纵坐标进行线性回归，得到的直线斜率为反应速率ΔA0、ΔA。
式中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化法速率；ΔA为加入样液后邻苯三酚自氧化法速率，单位均为吸光度每分钟的增值。
（3）羟自由基（·OH）清除率的测定[13]
采用水杨酸法。在具塞试管中依次加入2 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、取样液2 mL和1 mmol/L H2O22 mL，摇匀，于37 ℃水浴中反应30 min，在波长510 nm下测定吸光度值AX。并按相同方法，测定不加样液的溶液的吸光度值A0，不加H2O2的溶液的吸光度值AX0，均以蒸馏水为参比。
式中：A0为空白对照液的吸光度值；AX为加入样液后的吸光度值；AX0为不加H2O2的样液本底的吸光度值。
1.3.9 数据分析
单因素试验每组重复3次，实验结果以平均值±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 苹果玫瑰醋复合饮料中有机酸组成分析
按照高效液相色谱分析条件测定，7种有机酸混标分离效果较好，在相同的色谱条件下进样，以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制出不同有机酸的标准曲线回归方程见表1。由表1可知，各有机酸标品的标准曲线相关系数R2＞0.999 0，线性范围良好，可用于样品定量分析。
表1 各种有机酸的回归方程及相关系数
Table 1 Regression equation and correlation coefficient of organic acids
表2 苹果玫瑰醋复合饮料中有机酸含量
Table 2 Organic acid content of apple rose vinegar compound beverage
苹果醋中含有丰富的乙酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等有机酸，其中乙酸含量占总酸含量的90%以上，是主要的酸味来源，其他酸味起协调、柔和酸味的作用。以苹果醋、玫瑰水提物为主料调配而成的苹果玫瑰醋复合饮料中乙酸含量为2 742.2 μg/mL，琥珀酸含量为441.5 μg/mL，苹果酸含量为399.2 μg/mL，柠檬酸含量为246.1 μg/mL，符合国家标准GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》中主要有机酸含量的要求。乙酸的酸味具有刺激性，琥珀酸有鲜味，苹果酸爽快，柠檬酸酸味圆润，这些物质酸味各异，比例协调，共同构成了苹果玫瑰醋复合饮料特有的酸味。
2.2 苹果醋复合饮料中氨基酸组成与含量
对苹果玫瑰醋复合饮料中的游离氨基酸进行测定，结果见表3。
表3 苹果玫瑰醋饮料中游离氨基酸含量
Table 3 Contents of free amino acids of apple rose vinegar compound beverage
注：“△”：呈味氨基酸；“*”：必需氨基酸。
由表3可知，苹果玫瑰复合醋饮料中含有16种游离氨基酸，氨基酸总量为441.47 μg/mL，其中异亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸的含量较高，分别达到233.10 μg/mL、68.06 μg/mL、47.84 μg/mL、30.49 μg/mL。异亮氨酸与亮氨酸和缬氨酸一起合作有修复肌肉、控制血糖作用。氨基酸是维系人体生命活动的重要物质，它不仅具有各种生理功能，而且对果醋的酸味具有缓冲作用，使其更加柔和、鲜美、醇厚[14-15]，并给身体组织提供能量的作用，丝氨酸是脑等组织中丝氨磷酸脂的组成部分，有降低血液中的胆固醇浓度、防治高血压的作用[16-18]。由此可见，苹果玫瑰醋复合饮料中氨基酸种类丰富，含量较高，具有一定营养价值。
苹果玫瑰复合醋饮料中共含有7种必需氨基酸，必需氨基酸总量为273.35μg/mL，占总氨基酸含量的61.92%，其中异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸含量较高，分别为233.10 μg/mL、21.79μg/mL和12.21μg/mL；含有呈味氨基酸总量为64.83μg/mL，占总氨基酸含量的14.69%。其中天冬氨酸与味觉中的酸味形成有关，甘氨酸、丙氨酸与甜味有关，谷氨酸与鲜味物质形成有关，苹果玫瑰醋复合饮料中天冬氨酸含量为47.84 μg/mL，谷氨酸含量为6.57 μg/mL，丙氨酸含量为4.6 μg/mL，甘氨酸含量为1.29 μg/mL，这些氨基酸在提高苹果玫瑰复合醋饮料营养品质的基础上，进一步丰富了果醋饮料的口感和滋味。
2.3 苹果玫瑰醋复合饮料中的营养成分
苹果玫瑰醋复合饮料中蛋白质、脂类、碳水化合物、钠等基本营养成分及能量的测定结果见表4。
表4 苹果玫瑰醋复合饮料营养及能量测定结果结果
Table 4 Determination results of nutritional components and energy of apple rose vinegar compound beverage
蛋白质、脂肪、碳水化合物和钠在我国是最具有公共卫生意义的营养素。缺乏可以引起营养不良、影响儿童和青少年生长发育和健康，过量导致肥胖和慢性病发生发展。由表4可知，苹果玫瑰醋饮料中能量82 kJ/100 mL，碳水化合物含量为4.5 g/100 mL，钠含量为18 mg/100 mL，蛋白质、脂肪含量甚微以0计。与市场上其他饮料比较，碳水化合物含量、能量较低，适宜日常饮用。
2.4 苹果玫瑰醋复合饮料抗氧化性测定
2.4.1 苹果玫瑰醋复合饮料中酚类物质含量
对苹果玫瑰醋复合饮料中单体酚类物质含量进行测定，结果见表5。由表5可知，7种单体酚总含量为266.97 μg/mL，其中没食子酸和香草酸含量较高，分别为162.42 μg/mL、97.09 μg/mL。酚类物质具有抗氧化、抗自由基等生物活性及抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理作用，谢晓燕等[19-20]研究表明，没食子酸在质量浓度5～50 μg/mL范围内对DPPH自由基有明显的清除能力，在质量浓度50～400 μg/mL范围内对羟自由基有明显的清除能力。李晓娇等[3]研究表明，苹果醋中没食子酸、香草酸、阿魏酸等含量相对较低，结果表明，苹果玫瑰醋复合饮料中酚酸含量相对较高，具有较强的抗氧化性。进一步说明苹果醋中添加玫瑰提取液复配工艺配方提高了果醋饮料中酚类物质含量，改变了果醋饮料的营养成分，提高了抗氧化能力。
表5 苹果玫瑰醋复合饮料中酚类物质含量
Table 5 Contents of phenolic substances in apple rose vinegar compound beverage
2.4.2 苹果玫瑰醋复合饮料抗氧化性结果
以苹果醋单一饮料为对照，进行不同玫瑰提取液含量（0～500 μL/mL）的复合果醋清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基实验，结果如图1所示。
图1 苹果玫瑰醋复合饮料对DPPH自由基（A）、超氧阴离子自由基（B）和羟自由基（C）清除率
Fig.1 DPPH free radical (A),superoxide anion radical (B) and hydroxyl radical (C) scavenging rate of apple rose vinegar compound beverage
由图1可知，苹果玫瑰醋复合饮料和苹果醋单一饮料（玫瑰提取液浓度为0）对3种自由基均有一定清除能力，随着复合果醋中玫瑰提取液添加浓度的增加，自由基清除能力显著提高，当果醋饮料中玫瑰提取液浓度增加至500μL/mL时，苹果玫瑰醋复合饮料DPPH自由基清除率为93.82%，羟自由基清除率为76.58%，超氧自由基清除率为54.61%，且复合饮料的抗氧化性能显著高于单一饮料（P＜0.05）。抗氧化能力是各类具抗氧化性保健因子的综合效应，在单一苹果醋饮料中添加一定量的玫瑰提取液对果醋饮料的抗氧化能力起着显著的影响，但玫瑰提取液添加量过高会造成饮料浑浊和涩味加重，故在复合饮料的调配中需综合考虑。
3 结论
对自制的苹果玫瑰醋复合饮料进行营养成分及抗氧化活性分析，结果显示：苹果玫瑰醋复合饮料中有机酸含量丰富，其中乙酸含量为2 742.2 μg/mL，琥珀酸含量为441.5 μg/mL，苹果酸含量为399.2 μg/mL，柠檬酸含量为246.1 μg/mL，它们相互协调组成产品特有的酸味。苹果玫瑰醋复合饮料中含有16种氨基酸，总量达到441.47 μg/mL，必需氨基酸7种，总量为273.35 μg/mL，占总氨基酸含量的61.92%；呈味氨基酸5种，含量为64.83 μg/mL，占总氨基酸含量的14.69%。对饮料中的基本营养素进行测定，结果显示能量为82 kJ/100 mL，碳水化合物含量为4.5 g/100 mL，不含蛋白和脂肪。对果醋饮料中的抗氧化活性成分及抗氧化能力进行研究，结果显示复合果醋饮料中没食子酸含量达到162.42 μg/mL。当复合果醋中玫瑰提取液体积分数为500 μL/mL时，其DPPH自由基清除率为93.82%，羟自由基清除率为76.58%，超氧阴离子自由基清除率为54.61%，与单一苹果醋饮料相比，复合果醋饮料抗氧化性能明显提高。
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