异丙威又名灭扑散、叶婵散，属于氨基甲酸酯类农药。1970年，异丙威被推荐用作杀虫剂，触杀作用较强，在防治水稻害虫中发挥了重要作用。近年来，由于异丙威在农作物中的使用量不断增加，导致了农药残留量较高，人体食用了农药残留较多的农作物，危害健康。
异丙威属于速效性农药，应用较为广泛，然而快速检测方法或文献很少。目前，检测异丙威药物残留的方法多为仪器方法[1]，主要有气相色谱质谱法[2-5]、高效液相色谱法[6-11]、分散型固相萃取-气相色谱法[12]、薄层扫描法[13]等，操作较复杂，成本较高，仪器方法较难应用于基层实验室的大批量样本检测，目前尚未查阅到胶体金免疫层析法检测异丙威的相关文献，因此，本实验采用快速检测方法中的胶体金免疫层析法，研制一种异丙威胶体金免疫层析试纸条，以期建立能够检测蔬菜、水果中的异丙威农药残留的异丙威胶体金免疫快速检测试纸条，具有实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
异丙威标准品（纯度≥95%）、甲草胺标准品（纯度≥95%）、亚胺菌标准品（纯度≥95%）、乙霉威标准品（纯度≥95%）、异丁草胺标准品（纯度≥95%）：北京标准物质研究中心；氯金酸（HAuCl4·3H2O）（分析纯）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（分析纯）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（分析纯）：美国Sigma公司；柠檬酸三钠（分析纯）、碳酸钾（分析纯）、4-氨基-2-异丙基苯酚（分析纯）、三乙胺（分析纯）、乙酸乙酯（分析纯）、二氯甲烷（分析纯）、正己烷（分析纯）、吡啶（分析纯）、石油醚（分析纯）、三氟乙酸（分析纯）、三氯甲烷（分析纯）、硫酸钠（分析纯）、亚硝酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：北京中生百欣科技服务有限责任公司；蔬菜、水果：城北农贸市场；样本提取剂（0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液）、样本复溶液（0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液）：北京勤邦生物技术有限公司；8周龄小鼠：斯贝福（北京）生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
GT-700胶体金分析仪：北京勤邦生物技术有限公司；MX-F涡旋仪、HFJ-10均质器：湖南湘立科学仪器有限公司；JA2003电子天平：上海力辰仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 异丙威半抗原的制备
取4-氨基-2-异丙基苯酚1.51 g，加二氯甲烷50 mL溶解，加二碳酸二叔丁酯2.18 g，三乙胺0.4 mL，室温搅拌4 h，停止反应，旋蒸，除去有机溶剂，加水30 mL，乙酸乙酯40 mL×3萃取3次，合并有机相，蒸干，二氯甲烷∶正己烷（1∶7，V∶V）90 mL重结晶，得到化合物Ⅰ2.3 g，收率92%。
取化合物Ⅰ2.3 g，加无水丙酮60 mL溶解，0～5 ℃条件下，滴加异氰酸甲酯0.73 g，加吡啶1.2 mL，充分搅拌后，恢复至室温，继续搅拌3 h；旋蒸，除去有机溶剂，上硅胶柱，石油醚∶乙酸乙酯（5∶1，V∶V）洗脱分离，得到化合物Ⅱ2.7 g，收率96.43%。
取化合物Ⅱ2.7 g，加三氟乙酸40 mL溶解，室温搅拌6 h后停止反应，旋蒸，除去溶剂，加三氯甲烷100 mL，溶解澄清，水洗三次，取有机相，无水硫酸钠干燥后，蒸干，加乙酸乙酯：正己烷（1∶10，V∶V）120 mL进行重结晶，得到氨基异丙威半抗原产物1.4 g，收率77%。
异丙威半抗原的合成见图1。
图1 异丙威半抗原的合成
Fig.1 Synthesis of isoprocarb hapten
1.3.2 免疫原的制备
取氨基异丙威半抗原50 mg，加1 moL/L盐酸0.48 mL，加水5 mL，搅拌溶解，静置5 min，0～5 ℃搅拌30 min，加亚硝酸钠17.2 mg，继续搅拌3 h，得到活化液A液；取BSA 500 mg，加0.1 moL/L氢氧化钠溶液30 mL溶解，0～5 ℃搅拌30 min，得到B液，将全部的A液滴加到B液中，搅拌4 h。0.02 moL/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）透析3 d，每天换液3次，得到异丙威-BSA免疫原，-20 ℃保存备用[19]。
1.3.3 包被原的制备
取氨基异丙威半抗原30 mg，加1 moL/L盐酸0.27 mL，加水5 mL，搅拌溶解，澄清，0～5 ℃搅拌30 min，加亚硝酸钠13.1 mg，继续搅拌3 h，得到活化液A液；取OVA 500 mg，加0.1 moL/L氢氧化钠溶液30 mL溶解，0～5 ℃搅拌30 min，得到B液，将全部的A液滴加到B液中，搅拌4 h。在0.02 moL/L PBS缓冲液中透析3 d，3 h换一次缓冲液，每天换液3次，得到异丙威-OVA包被原，-20 ℃保存备用。
1.3.4 单克隆抗体的制备
将免疫抗原与弗氏完全佐剂体积比1∶1充分乳化，免疫8周龄BaLb/c小鼠，取免疫后的鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选获得能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用体内诱生法[20]得到异丙威单克隆抗体溶液，-20 ℃保存。
1.3.5 胶体金的制备
取0.01%氯金酸水溶液100 mL加热至沸腾；一边搅拌，一边准确加入1%柠檬酸三钠溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15 min，冷却后，4 ℃避光保存。
1.3.6 异丙威单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2 moL/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，每毫升胶体金溶液中加入80 μg异丙威单克隆抗体，混匀，静置10 min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的体积分数为1%，静置10 min。离心、洗涤、重悬，4 ℃保存备用。
1.3.7 微孔试剂的制备
将100 μL异丙威单克隆抗体-胶体金标记物加入到微孔试剂微孔板中，置于冷冻干燥机，冷阱温度为-50 ℃，预冻3 h，再真空干燥15 h，即得到异丙威单克隆抗体-胶体金标记物冻干的微孔试剂。
1.3.8 样本中异丙威的检测
前处理方法：擦掉白菜/苹果样品表面泥土，剪成1 cm左右见方的碎片；称取样品1 g至烧杯或提取瓶中，加入5 mL磷酸盐缓冲液，振荡2 min；倒出样品溶液，静置3 min，将上清液倒入玻璃管中并进行编号，待检。
向微孔中加入100 mL待检样本溶液，混匀，室温下孵育3 min，吸取70 μL滴至试纸条上，反应10 min，根据图2判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果。其他时间判读无效。
图2 试纸条结果判定示意图
Fig.2 Schematic diagram of strip result determination
1.3.9 方法学考察
（1）试纸条的最低检出限
在空白蔬菜、水果样本中分别添加异丙威标准品至质量浓度为0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.8所述方法用3批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定试纸条的最低检出限（limit of detection，LOD）。
（2）试纸条的特异性
《农残办技术材料要求及审查程序》规定：采用与待检药物同类药物、类似物或可能联合使用的药物测定特异性，因此，本研究分别配制500 μg/L的甲草胺、亚胺菌、乙霉威和异丁草胺等药物，用此试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。
（3）试纸条的准确性
总局办公厅关于印发食品快速检测方法评价技术规范的通知（食药监办科〔2017〕43号）：以假阳性率和假阴性率评价胶体金免疫层析法的准确性。取50份用仪器测定的空白蔬菜、水果样品，用该试纸条检测异丙威药物残留，计算假阳性率；取50份用仪器测定的添加异丙威质量浓度至10 μg/kg的阳性蔬菜、水果样品，再用该试纸条检测异丙威药物残留，计算假阴性率。《农残办技术材料要求及审查程序》规定：试纸条假阳性率应＜5%，假阴性率应为零。
（4）试纸条的稳定性
将试纸条保存于2～8 ℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月。具体方法为：分别检测20份空白蔬菜、水果样品，添加异丙威质量浓度至10 μg/kg，重复测定2次，根据实验结果判定试纸条的稳定性。
2 结果与分析
2.1 胶体金的鉴定
肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好、无杂质、透明度较高。取冷却后的胶体金溶液在透射电镜下观察，结果见图3。由图3可知，胶体金颗粒的均一程度，测量金颗粒粒径，经透射电镜观察，胶体金颗粒分布比较均匀，金颗粒的粒径为20 nm左右。
图3 胶体金电镜扫描结果（×100 000）
Fig.3 Microscope scanning results of colloidal gold (×100 000)
2.2 试纸条的最低检出限
制备异丙威质量浓度分别为0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L的蔬菜、水果样品，按照1.3.8步骤进行检测，确定试纸条的最低检出限，结果见表1。由表1可知，0～8 μg/L检测结果为阴性，10～14 μg/L的检测结果为阳性，因此，该试纸条的最低检出限为10 μg/kg。
表1 试纸条的检出限
Table 1 Detection limit of test strip
注：“-”表示结果呈阴性，“+”表示结果呈阳性。
2.3 试纸条的特异性
按照1.3.9（2）步骤进行检测，使用该试纸条检测质量浓度为500 μg/L的甲草胺、亚胺菌、乙霉威和异丁草胺等药物标准品溶液，结果见图4。由图4可知，检测结果均呈阴性，表明该试纸条对以上药物无交叉，特异性较好。
图4 特异性试验结果
Fig.4 Results of specificity tests
2.4 试纸条的准确性
按照1.3.9节步骤进行检测，部分检测结果见图5。
图5 假阳性（A）及假阴性（B）试验结果
Fig.5 Results of false positive (A) and false negative (B) tests
由图5A可知，用试纸条检测50份空白蔬菜、水果样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率＜5%；由图5B可知，添加异丙威质量浓度为10 μg/kg的50份阳性蔬菜、水果样品，试纸条检测结果均为阳性，说明试纸条假阴性率为零，符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。
2.5 试纸条的稳定性
按照1.3.9节步骤进行检测，其中白菜部分检测结果见图6。由图6可知，12个月内，试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求，从第13个月起，试纸条会出现少量失效、假阴性等现象。因此，试纸条的稳定性良好。
图6 稳定性试验结果
Fig.6 Results of stability tests
3 结论
本研究通过制备异丙威半抗原，让其与载体蛋白偶联得到免疫原，最终制备出商品化的胶体金免疫层析试纸条。按照《农残办技术材料要求及审查程序》要求，对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，均符合要求。本试验研制的试纸条最低检出限为10 μg/kg，而且试纸条的检测时间仅为15 min，比现有文献中高效液相色谱法、气相色谱等仪器方法灵敏度更高，用时更短，操作更简便，仪器方法和薄层扫描法方法较为复杂，检测时间至少为1 h以上，对于基层检测单位来说，花费的时间成本和检测成本均很高，因此本研究的快速检测试纸条能够有效解决这个问题，具有实际应用价值。
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