白酒是中国特有的一种蒸馏酒，在我国有上千年历史[1-2]。白酒生产过程中会自然产生甲醇、乙醇和其他有机物质；由于甲醇和乙醇的沸点接近（分别在64.7 ℃和78.3 ℃），所以白酒中不可避免地含有一定量的甲醇[3]。甲醇是白酒中最主要的有害物质，对人体的毒作用是由甲醇本身及其代谢产物甲醛和甲酸引起的，主要侵害视神经，导致视网膜受损，视神经萎缩，视力减退和双目失明[4-11]。
2012年以来，国内白酒行业先后陷入“酒精勾兑”、“塑化剂”、“基酒外购”、“添加剂”等风波中，年份白酒问题、散装白酒中毒等质量安全事件接连发生，折射出我国白酒行业发展的诸多问题[12]。白酒造假主要在于掺加甲醇、杂醇油等物质[13]。有一些不法分子滥用工业酒精冒充食用酒精，用工业甲醇直接勾兑成“毒酒”，以牟取暴利，造成酒中甲醇含量远远高于国家规定的卫生标准[14]。而因饮用甲醇含量超标的白酒而造成的食物中毒事件仍时有发生。因此，建立白酒中甲醇含量的准确快速检测方法很有必要。
目前，检测酒类中甲醇的方法有比色法[15-19]、气相色谱法[20-24]、高效液相色谱法[25]、近红外光谱法[26]、激光拉曼光谱法[27]、Fourier变换红外光谱法[28]等，国家标准中甲醇的检测方法为气相色谱法[29]，这些方法存在测前处理复杂，灵敏度有限，定性准确度有待提高、设备检测成本高等问题。在国家标准GB 5009.266—2016《食品中甲醇的测定》中，对甲醇的检测采用氢火焰离子化检测器，由于白酒中挥发性成分复杂且沸点较低，在日常检验工作中发现，因保留时间相近，甲醇峰常受到乙酸乙酯、乙醇等沸点相似物质的干扰，造成基线不稳、峰重叠等情况的发生，故选择气相色谱质谱联用仪法测定以消除干扰物质。
三重四极杆质谱检测器能有效排除杂质干扰，提高检测的灵敏度、准确度。因此本研究采用气相色谱质谱技术，旨在建立三重四极杆多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式检测甲醇的方法，以期为白酒中甲醇的检测提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
甲醇（99.8%）、叔戊醇（99.5%）：德国Dr.Ehrenstorfer GmbH标准品有限责任公司；乙醇（色谱纯）：德国Merck有限公司；实验用水：Milli-Q超纯水机制备。
样品：青稞酒1批、酱香型白酒6批、浓香型白酒10批、清香型4批、其他香型6批。
1.2 仪器与设备
7000D-7890B气质联用仪：美国安捷伦科技有限公司；MSE125P-ICE-DU十万分之一天平：瑞士梅特勒-托利多有限公司；移液器：德国艾本德仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液配制方法
甲醇标准溶液配制：准确称取甲醇对照品0.111 36 g于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液（体积分数40%）定容制得11.11 mg/mL甲醇储备液。为研究确定本方法分别在低浓度范围和高浓度范围的准确性和稳定性，故分别配制低浓度范围（1号）和高浓度范围（2号）的甲醇标准曲线。
1号甲醇标准曲线的配制：准确吸取甲醇标准溶液0.1 mL于100 mL容量瓶中，用乙醇溶液（体积分数40%）定容制得11.11 μg/mL甲醇标准中间液，分别吸取不同含量的标准中间液，用乙醇溶液（体积分数40%）定容制得质量浓度为0、0.222 2 μg/mL、0.555 5 μg/mL、0.888 8 μg/mL、1.111 0 μg/mL、2.222 0 μg/mL、5.555 0 μg/mL、8.888 0 μg/mL、11.110 0 μg/mL的1号标准曲线。
2号甲醇标准曲线的配制：准确吸取甲醇标准溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇溶液（体积分数40%）定容制得1.111 mg/mL甲醇标准中间液，分别吸取不同含量的标准中间液，用乙醇溶液（体积分数40%）定容制得质量浓度梯度为0、11.11μg/mL、22.22 μg/mL、44.44 μg/mL、66.66 μg/mL、88.88 μg/mL、111.10 μg/mL、166.60 μg/mL、222.20 μg/mL的2号标准曲线。
1.3.2 仪器检测条件
气相色谱条件：毛细管色谱柱Agilent DB-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：40 ℃保持1 min，以4 ℃/min升至130 ℃，再以30 ℃/min升至200 ℃；进样口温度：250 ℃；进样方式：分流进样；分流比：40∶1；柱流量：1.0 mL/min；进样体积：1.0 μL。
质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电子能量：70 eV；扫描类型：MRM动态反应监测；前级离子质核比（m/z）：32；产物离子质核比（m/z）：31。
1.3.3 样品处理方法
为简化处理方法，减少易挥发物质的损失，本方法直接吸取样品1.5 mL于进样小瓶中待测，采用外标法定量。
1.3.4 计算公式
白酒中甲醇含量计算（测定结果按100%酒精度折算）：
X：试样中甲醇的含量，g/L；ρ：由标准曲线得出试样中甲醇的质量浓度，mg/L；c：试样的酒精度，%vol；100：按100%酒精度换算；1 000：单位换算系数。
1.3.5 数据处理
每次实验重复操作3次，取平均值。应用SPSS20.0软件和Excel进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 检测模式的选择
配制质量浓度为1.0 μg/mL的甲醇标准溶液，分别采用选择离子监测（select ion monitoring，SIM）模式及多反应监测模式（MRM）测定，分析谱图分别见图1、图2。
图1 单离子监测模式下甲醇溶液的色谱图
Fig.1 Chromatogram of methanol solution in single ion monitoring mode
图2 多反应监测模式下甲醇溶液的色谱图
Fig.2 Chromatogram of methanol solution in multiple reaction monitoring mode
由图1和图2可以看出，在SIM模式条件下，2.6 min甲醇峰未检出，由于溶剂乙醇含量较高、分子结构与甲醇近似、质核比相差较小，在气相色谱图中是相邻的两个峰，3.0 min的乙醇峰对甲醇检测有较大的干扰；而在MRM模式母离子质核比32，碎片离子质核比31条件下，2.6 min甲醇峰响应值较高，且有效降低乙醇峰的响应值，降低了乙醇干扰。
2.2 定量方法的选择
国家标准GB 5009.266—2016《食品中甲醇的测定》中定量方法选择内标法[29]，内标物质为叔戊醇。本实验室分别采用内标法和外标法分别对三个加标样品和一个阳性样品进行测定，结果见表1。由表1可知，内标法与外标法测定白酒中甲醇结果无显著差异（P＞0.05）。
表1 定量方法对比结果
Table 1 Comparison of quantitative methods
2.3 方法学验证
2.3.1 线性范围
图3 1号（A）及2号（B）甲醇溶液标准曲线
Fig.3 Standard curve of methanol solution No.1 (A) and No.2 (B)
分别配制两套不同质量浓度范围的甲醇标准溶液，按照上述条件测定，以质量浓度（μg/mL）对相应的峰面积进行线性回归，得甲醇标准溶液的标准曲线（图3）及检测范围、相关系数。由图3可知，本方法测定甲醇在0.2～10 μg/mL、10～200 μg/mL范围内线性均良好，相关系数R2均＞0.999，说明在低浓度范围和高浓度范围都能够准确定量分析。
2.3.2 精密度试验
分别在50 mL容量瓶中添加0.5 mL、5.0 mL 100 μg/mL的甲醇标准溶液，并用乙醇溶液（体积分数40%）定容，配制成质量浓度分别为1.0 μg/mL、10.0 μg/mL的标准溶液，两个质量浓度分别进样6次，计算精密度，结果见表3。实验结果表明，各组的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均＜5%，重现性好，精密度能达到实验要求。
表3 精密度试验结果
Table 3 Results of precision tests
2.3.3 检出限试验
将10 μg/mL甲醇标准使用液逐步稀释，当稀释至甲醇质量浓度为0.1 μg/mL时，峰高为基线噪声的3倍，于是将0.1 μg/mL作为方法检出限。与国家标准GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定方法》检出限7.5 mg/mL相比，国标法检出限为本方法检出限的75倍，本方法显著提高了检测灵敏度。
2.3.4 回收率试验
取一空白样品，添加1 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL甲醇质量浓度水平的四组白酒做加标回收试验，每组做6份平行，结果见表4。由表4可知，4组平均回收率分别为89.17%、92.28%、96.63%、98.52%，回收率试验结果RSD在1.54%～2.39%之间，回收率较高且稳定，准确度符合测定要求。
表4 方法回收率试验结果
Table 4 Results of recovery rates tests of method
2.4 实际样品的测定
采用优化的实验条件对26个白酒样品进行检测，结果表明25批白酒样品甲醇均小于国家标准GB 2757—2012《食品安全国家标准蒸馏酒及其配制酒》[30]中规定的限量值0.6 g/L，而疑似阳性样品的检测结果远超过国家标准限量值0.6 g/L，其色谱图见图4。可见市场上仍存在个别白酒样品甲醇含量超标的现象。
图4 某白酒阳性样品色谱图
Fig.4 Chromatogram of a Baijiu postive sample
3 结论
本研究建立了气相色谱-质谱联用法多反应监测模式测定白酒中的甲醇，选定的色谱质谱条件为：毛细管色谱柱Agilent DB-FFAP（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温；进样口温度：250 ℃；进样方式：分流进样；分流比：40∶1；柱流量：1.0 mL/min；进样体积：1.0 μL；电子电离源，离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电子能量：70 eV；扫描类型：MRM动态反应监测；前级离子质核比（m/z）：32；产物离子质核比（m/z）：31。通过检测条件优化和方法学验证，该方法快速、简便、准确，提高了甲醇测定的灵敏度和抗干扰能力，为白酒中甲醇检测、白酒质量控制提供了新的方法。
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