纳豆菌（Bacillus natto）是从日本传统食品纳豆中分离出来的无病原性的安全菌株[1]，其发酵作用能使蛋白质等营养成分分解为更利于消化吸收的小分子化合物[2-3]，并产生纳豆激酶等多种生理活性物质，从而使发酵食品表现出独特的营养特点和生理功能[4-7]。故长期以来纳豆菌在食品发酵领域占领着重要的位置，成为研究的热点。
直投式纳豆菌发酵剂发酵性能强，使用方便，其不仅能简化纳豆制品生产工艺，还可防止菌种退化及污染，有利于保证产品质量的稳定[8-11]。但目前直投式纳豆菌发酵剂的制备技术较复杂，一般要先将纳豆菌高密度培养后收集菌体，再添加保护剂后通过喷雾干燥或真空冷冻干燥而成[12-14]，制备工艺复杂、周期长、成本高。因此寻找工艺简便、成本低的直投式纳豆菌发酵剂制备技术是研究的重要方向。
本研究以大米粉为基质替代传统的液态种子液培养基扩大培养纳豆菌，通过单因素试验及正交试验优化其培养条件，并将培养物直接烘干制成纳豆菌发酵剂，以期得到一种活菌数高、发酵活力强且制备简便、生产成本低的直投式纳豆菌发酵剂。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
纳豆菌（Bacillus natto）（CICC 10023）：江西省食品发酵研究所微生物实验室；大米粉：市售；蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、酵母膏（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；尿素、硫酸铵（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
营养肉汤培养基[15]：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，pH 7.4，121 ℃灭菌20 min。大米粉培养基[16]：将过80目筛的大米粉装入三角瓶中，121 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
ML204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；QYC-2102恒温培养振荡器：上海新苗医疗器械制造有限公司；LDZF-75KB高压灭菌锅、GZX-9240MBE电热鼓风干燥箱：上海申安医疗器械厂；DH3600电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 直投式纳豆菌发酵剂制备工艺流程及操作要点
培养基制备→种子液制备→接种→发酵培养→烘干→发酵剂
操作要点：
（1）培养基的制备：向灭菌的大米粉培养基中添加适量的氮源，再加入适量无菌水，混匀、备用。
（2）种子液：将纳豆菌接种于营养肉汤培养基中，在35 ℃、150 r/min条件下活化16 h，即得种子液[17]。
（3）接种、发酵培养：将纳豆菌种子液按一定的接种量接入制备好的培养基中，在一定温度静置发酵培养一段时间。
（4）烘干：将培养物装入无菌信封中，置于烘箱中先以45 ℃干燥6 h，再以60 ℃干燥12 h，拍散，即得直投式纳豆菌发酵剂。
1.3.2 氮源种类对纳豆菌生长的影响
以大米粉为基质增殖纳豆菌，向大米粉培养基中分别添加1.0%的大豆蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵，再加入35%无菌水，以3%（V/V）的接种量接入纳豆菌种子液，在37 ℃条件下静置培养24 h，将其装入无菌信封中，置于烘箱中烘干制成直投式纳豆菌发酵剂。采用平板菌落计数法[14]测定发酵剂中纳豆菌活菌数，考察氮源种类对纳豆菌生长的影响。
1.3.3 氮源含量对纳豆菌生长的影响
在最佳氮源条件下，向大米粉培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的氮源，其他条件保持不变，对纳豆菌进行培养，并烘干制成直投式纳豆菌发酵剂。测定发酵剂中纳豆菌活菌数，以确定最佳氮源含量。
1.3.4 直投式纳豆菌发酵剂发酵条件优化单因素试验
选取最适氮源及其含量添加于大米粉培养基中，接入纳豆菌种子液，在一定条件下进行固态扩大培养，分别考察接种量（2%、3%、4%、5%、6%）、加水量（25%、30%、35%、40%、45%）、培养时间（20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h）、培养温度（31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃）对纳豆菌生长的影响。将培养物烘干制成直投式纳豆菌发酵剂，测定发酵剂中纳豆菌活菌数，以确定最佳培养条件。
1.3.5 直投式纳豆菌发酵剂发酵条件优化正交试验
以单因素试验为基础，选取对纳豆菌生长影响较大的接种量（A）、加水量（B）、培养温度（C）及培养时间（D）4个因素进行正交试验，以发酵剂中纳豆菌活菌数为评价指标，得到最佳直投式纳豆菌发酵剂制备工艺。正交试验因素与水平见表1。
表1 直投式纳豆菌发酵剂发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of directed vat set Bacillus natto starter culture
1.3.6 数据处理
每个试验做3个平行，结果取平均值，并采用DPS v6.55和Excel 2007软件处理分析试验数据。
2 结果与分析
2.1 氮源种类对纳豆菌活菌数的影响
图1 氮源种类对纳豆菌活菌数的影响
Fig.1 Effect of nitrogen source types on the viable count of Bacillus natto
由图1可知，不同种类的氮源对纳豆菌生长的影响不同，与对照组（未添加氮源的大米粉培养基）相比，有机氮源的添加促进了纳豆菌的生长，其中以添加了蛋白胨的大米粉培养基培养纳豆菌得到的活菌数最多，干燥后制成的发酵剂中活菌数达6.86×108 CFU/g，而无机氮源不利于纳豆菌的生长，活菌数较低，这与李情敏等[17]的研究结果一致。因此，确定最佳氮源为蛋白胨。
2.2 蛋白胨添加量对纳豆菌活菌数的影响
图2 蛋白胨添加量对纳豆菌活菌数的影响
Fig.2 Effect of peptone addition on the viable count of Bacillus natto
由图2可知，随着大米粉中蛋白胨添加量的增加，纳豆菌活菌数呈先增大后减小的趋势，当蛋白胨添加量为1.5%时，培养基营养物质丰富，菌体生长旺盛，将培养物烘干后制成的发酵剂中活菌数最高，达9.04×108 CFU/g。因此，确定最佳蛋白胨添加量为1.5%。
2.3 接种量对纳豆菌活菌数的影响
图3 接种量对纳豆菌活菌数的影响
Fig.3 Effect of inoculum on the viable count of Bacillus natto
由图3可知，不同接种量对纳豆菌生长的影响不同，随着接种量的增大，纳豆菌活菌数呈先增大后减小的趋势，分析原因可能是接种量过小，迟缓期延长，菌体生长代谢慢，接种量过大，菌体生长过快，造成菌体提前衰亡[18]，活菌数降低。当接种量为4%时，最有利于纳豆菌的生长，活菌数达最高，为1.17×109 CFU/g。因此，确定最佳接种量为4%。
2.4 加水量对纳豆菌活菌数的影响
图4 加水量对纳豆菌活菌数的影响
Fig.4 Effect of water addition on the viable count of Bacillus natto
由图4可知，随着加水量的增加，纳豆菌活菌数呈先增大后减小的趋势，其原因可能为加水量过小时，纳豆菌能利用的水分过少，抑制了纳豆菌的生长繁殖，而加水量过大时，氧气供应量不足，造成纳豆菌生长状况不佳[19]，当加水量为35%时，菌体生长最旺盛，活菌数最高，为9.04×108CFU/g。因此，确定最佳加水量为35%。
2.5 培养时间对纳豆菌活菌数的影响
由图5可知，培养时间对纳豆菌的生长影响较大，培养时间＜32 h之前，纳豆菌活菌数随着培养时间的增加而增加，继续延长培养时间，活菌数反而降低，可能是由于培养时间过长，代谢产物积累，造成菌体死亡。当培养时间为32 h时，活菌数达到最大，为1.25×109 CFU/g。因此，确定最佳培养时间为32 h。
图5 培养时间对纳豆菌活菌数的影响
Fig.5 Effect of culture time on the viable count of Bacillus natto
2.6 培养温度对纳豆菌活菌数的影响
温度对微生物的生长代谢有重要影响，其会影响菌体细胞内各种酶的活性及蛋白质等物质的合成[20]，进而影响菌体细胞的生长。
图6 培养温度对纳豆菌活菌数的影响
Fig.6 Effect of culture temperature on the viable count of Bacillus natto
由图6可知，纳豆菌活菌数随着培养温度的升高呈先增加后降低的趋势，分析原因可能是温度过低，纳豆菌生长缓慢，温度太高，菌体过早衰亡。当培养温度为40 ℃时，最有利于纳豆菌的生长，活菌数最高，达1.04×109 CFU/g。因此，确定最佳培养温度为40 ℃。
2.7 直投式纳豆菌发酵剂发酵工艺优化正交试验结果
对正交试验所得数据进行分析处理，正交试验结果与分析见表2，方差分析结果见表3。
由表2可知，影响纳豆菌活菌数的主次因素依次为接种量＞加水量＞培养时间＞培养温度。由表3可知，接种量及加水量对纳豆菌活菌数的影响极显著（P＜0.01），培养时间对纳豆菌活菌数的影响显著（P＜0.05），培养温度对纳豆菌活菌数的影响不显著（P＞0.05）。故由极差分析和方差分析结果可知，纳豆菌生长的最优培养条件组合为A2B3C3D1，即接种量4.0%、加水量40%、培养温度43 ℃、培养时间28 h。在此最优发酵条件下，最终制得的直投式纳豆菌发酵剂中纳豆菌活菌数含量达4.71×109 CFU/g，高于张雯等[21]采用喷雾干燥制备的纳豆菌菌剂（6.5×108 CFU/g），该直投式纳豆菌发酵剂达到了市售发酵剂的标准要求[22]。因此，确定直投式纳豆菌发酵剂的最佳培养条件为接种量4.0%、加水量40%、培养温度43 ℃、培养时间28 h。
表2 直投式纳豆菌发酵剂发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of directed vat set Bacillus natto starter culture
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
3 结论
本研究以添加1.5%蛋白胨的大米粉替代传统的种子液培养基培养纳豆菌，通过单因素及正交试验优化纳豆菌的培养条件，得出纳豆菌的最佳培养条件为接种量4.0%、加水量40%、培养温度43 ℃、培养时间28 h。在此优化条件下，纳豆菌生长良好，菌体量多，将培养物烘干后制成的直投式纳豆菌发酵剂中的活菌数含量达4.71×109 CFU/g。该纳豆菌发酵剂达到了市售发酵剂的标准要求，采用此技术制备直投式纳豆菌发酵剂可简化生产过程，对设备要求低，成本低，因此市场前景广阔。
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