沙果（Malus asiatica）又名花红，属蔷薇科苹果属植物，在我国东北和内蒙古等地区栽培广泛[1]。其果实形似苹果，成熟沙果口感酸甜，富含糖类、蛋白质、有机酸、单宁、维生素和钾、钠、镁、铁、锌等矿物质，具有较高的营养价值[2-3]。沙果性味甘凉，具有生津润燥、涩精止泻、清火明目、杀虫解毒的功效[4]。沙果中的多酚物质具有天然抗氧化能力，能有效清除羟基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基，可减轻氧化损伤，具有防癌、抑制衰老、改善血液循环等功效[5-7]。目前沙果加工业相对落后，仅在产地部分鲜食消费或加工成低附加值的沙果干、沙果酱，造成沙果资源的大量浪费[8]。因此本试验以新鲜沙果为原料酿制沙果果酒，优化其发酵工艺条件，并考察其抗氧化活性，以期有效利用沙果资源，降低沙果损失率，提高沙果的产业价值，为野生、低值果品的开发利用提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙果、白砂糖：市售；酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；氢氧化钠、葡萄糖、次甲基蓝、硫酸铜、酒石酸钾钠、福林酚试剂、柠檬酸、没食子酸、碳酸钠、甲醇、DPPH（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
722-P型数显分光光度计：上海现科分光仪器有限公司；WD-9415C型超声波清洗器：北京六一生物科技有限公司；FA2004型电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；JYZ-D51榨汁机：九阳股份有限公司；MYT-II型糖度计：上海光华仪器仪表厂。
1.3 试验方法
1.3.1 沙果果酒加工工艺流程及操作要点[9]
沙果→挑选→去梗→清洗→榨汁→护色→过滤→调整成分→接种→主发酵→后发酵→澄清→陈酿→沙果果酒
操作要点：
挑选、去梗、清洗：挑选果形均匀、成熟度好、着色良好、无病虫害及机械伤的沙果果实，剪断果梗，挖掉果蒂，置于清水中浸泡10 min后清洗干净。
榨汁、护色、过滤：称取250 g洗净的沙果，切半，置于榨汁机中榨汁。榨汁后，向汁液中添加0.5%抗坏血酸与1.0%柠檬酸的混合护色剂，防止果汁褐变。用40目纱布过滤，分离汁渣，果渣中添加50 mL蒸馏水，再次过滤，将两次滤得的沙果果汁混合。
调整成分：测定混合后的沙果果汁的糖含量和总酸度，根据试验设计用白砂糖和柠檬酸调整发酵汁成分。
接种、发酵：按照0.2 g/L的接种量用酿酒酵母进行接种。取少量发酵汁，添加酵母，置于40 ℃条件下活化1 h，将活化后的酵母加入发酵汁中，混匀，封闭发酵。
后发酵、澄清：将主发酵完成的果酒进行过滤除渣，更换容器继续密封发酵，直至酒体成熟，自然澄清即得成品。
陈酿：酿得的沙果果酒长期密封保存，使得酒体酒质澄清、风味浓厚。
1.3.2 沙果果酒酿造单因素试验设计
以酒精度和感官评分为评价指标，分别考察发酵时间（6 d、8 d、10 d、12 d、14 d）、发酵温度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃）、初始糖度（16°Bx、18°Bx、20°Bx、22°Bx、24°Bx）和初始pH（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）对沙果果酒品质的影响，确定适宜的发酵条件范围。
1.3.3 沙果果酒酿造正交试验设计
根据沙果果酒酿造单因素试验的结果，选择发酵时间（A）、发酵温度（B）、初始糖度（C）和初始pH（D）进行正交试验，筛选沙果果酒酿造的最佳发酵条件。正交试验的因素与水平如表1所示。
表1 沙果果酒发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of crab apple wine
1.3.4 测定方法
感官评定：挑选10位果酒品评经验丰富的专业人员，根据表2沙果果酒感官评价标准从色泽（20分）、气味（30分）、滋味（40分）和形态（10分）4个方面进行评分[10-12]。
理化指标的测定：按照国标GB 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》检测沙果果酒的酒精度[13]。按国标GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》检测总酸和总糖[14]。
微生物指标的测定：按国标GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》检测菌落总数[15]。按国标GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》检测大肠菌群[16]。
表2 沙果果酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of crab apple wine
抗氧化能力分析：采用福林酚试剂法测定沙果果酒发酵过程中的总酚含量[17-18]；采用DPPH法测定沙果果酒抗氧化能力[19-20]。
2 结果与分析
2.1 发酵时间对沙果果酒品质的影响
图1 发酵时间对沙果果酒品质的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of crab apple wine
由图1可知，随着发酵时间的延长，沙果果酒的酒精度不断升高，感官评分则呈先升高后降低的趋势。发酵时间为6～8 d时，酒精度上升较为迅速，在第8天时达到9.4%vol，在8 d后酒精度的上升趋势逐渐变缓。起初，随着酒精度的上升，感官评分也呈现了上升的趋势，在12 d时感官评分达到最高，为89.4分，随后略微降低。沙果果酒酿造过程中，发酵时间不足，会造成酒精度不够，产品风味较差；发酵时间过长，由于发酵液糖度和酵母菌能力的限制，酒精度不再升高，且容易产生酵母菌自溶以及杂菌污染等问题，降低果酒的品质。因此，选取适宜的发酵时间为12 d。
2.2 发酵温度对沙果果酒品质的影响
图2 发酵温度对沙果果酒品质的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of crab apple wine
由图2可知，随着发酵温度的升高，沙果果酒的酒精度和感官评分都呈现出先升高后降低的趋势。当发酵温度为20 ℃时，发酵完成后的沙果果酒酒精度为10.5%vol，感官评分为83.5分，产品果香浓郁，但酒味稍嫌单薄，酸味稍重，原因可能是发酵温度较低，酵母菌增殖和发酵速度较慢，少量杂菌生长，利用糖类产生酸类物质。当发酵温度为24 ℃时，产品酒精度升高至10.9%vol，酒香味增加，感官评分为87.6分，表明该温度适于酵母菌生长和发酵，酵母菌快速繁殖和酒精度的提升抑制杂菌生长，产品品质较好。随着发酵温度继续升高，沙果果酒酒精度逐渐降低，产品果香、酒味减弱，逐渐产生酸味等异味，由此可见，过高的发酵温度适于杂菌生长，大量杂菌利用果汁营养成分发酵，产生小分子醛、酮、酸等物质，抑制酵母发酵产生酒精，导致产品异味增加，酒精度降低。因此，选取适宜的发酵温度为24 ℃。
2.3 初始糖度对沙果果酒品质的影响
图3 初始糖度对沙果果酒品质的影响
Fig.3 Effect of initial sugar content on the quality of crab apple wine
由图3可知，在发酵液初始糖度为16～22 °Bx时，随着发酵液初始糖度的升高，发酵产物的酒精度也随之提高，产品酒味愈加醇厚，产品感官评价得分明显升高；当发酵液初始糖度高于22 °Bx时，产品酒精度升高不明显，可能是由于过高的糖浓度抑制了酵母菌的生长所致，此时感官评分略有降低；发酵液初始糖度为22°Bx时，制得沙果酒口感清爽，带有清新的酸甜口感和浓醇的酒味，产品感官评价得分为94分，酒精度为10.8%vol，品质较好。因此，选取适宜的初始糖度为22°Bx。
2.4 初始pH对沙果果酒品质的影响
pH值能够影响发酵副产物从而影响酿酒酵母菌的生长[21]。由图4可知，发酵液初始pH值为3.4时，产品的酒精度为10.2%vol，由于pH值过低，酵母菌的生长繁殖受到限制，不能快速繁殖并占据优势，同时杂菌生长并利用糖类发酵，导致产品酒精度较低，产品酸味过重，感官评分较低。初始pH值在3.4～3.8范围内时，随着pH值逐渐升高，酵母菌生长状态改善，产品的酒精度逐渐提高，pH值为3.8时，酒精度最高，为11.8%vol，随着pH值继续升高，产品酒精度有所降低。当初始pH值为4.0时，产品的感官品质最好，pH值继续上升，产品的酒味减淡，酸味及其他异味增加，产品浑浊，感官品质降低。因此，选取适宜的初始pH为3.8。
图4 初始pH对沙果果酒品质的影响
Fig.4 Effect of initial pH on the quality of crab apple wine
2.5 正交试验结果与分析
表3 沙果果酒发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization of crab apple wine
由表3可知，4种因素影响沙果果酒感官品质的主次顺序依次为B＞C＞D＞A，即发酵温度＞初始糖度＞初始pH＞发酵时间。沙果果酒的最佳酿造工艺为A2B2C2D3，即发酵时间12 d、发酵温度24 ℃、发酵液初始糖度22°Bx、初始pH4.0。由于正交试验中未出现最优组合，故按此工艺进行验证试验，所得产品感官评分为95.1，确定A2B2C2D3为沙果果酒酿造的最佳工艺条件。
2.6 沙果果酒的成品质量指标检测
感官指标：色泽呈浅黄色，澄清透亮，滋味清爽，有浓郁的沙果果香和醇厚的酒香。
理化指标：酒精度为11.8%vol，总酸含量为6.8 g/L，总糖含量为40.3 g/L。
微生物指标：菌落总数6 CFU/mL，大肠菌群＜3.0 MPN/100 mL。
均符合农业行业标准NY/T 1508—2017《绿色食品果酒》的要求。
2.7 沙果果酒的抗氧化活性研究
分别取1 mL沙果果汁和果酒的10倍稀释液测定多酚含量；分别取0.1 mL沙果果汁和果酒的5倍稀释液测定DPPH自由基清除率，结果见图5。
图5 沙果果汁和果酒中的多酚含量及DPPH自由基清除率
Fig.5 Polyphenol content and DPPH free radical scavenging rate of malusasiatica and malusasiatica wine
由图5可知，沙果果汁和果酒中的多酚含量分别为427 μg/mL和498 μg/mL，DPPH自由基清除率分别为29.5%和52.0%。可见，沙果果酒中多酚含量略高于其在沙果果汁中的量，这可能是因为酵母菌的作用使多酚物质进一步浸出，同时酒精的产生促进了某些多酚的溶解，可见沙果果酒有效保存了沙果原料中的多酚物质。沙果果汁和果酒都有一定的DPPH自由基清除能力，且随着多酚含量的增加，沙果果酒的DPPH自由基清除率更高，表现出更强的抗氧化活性。
3 结论
通过单因素试验和正交试验优化沙果果酒的最佳发酵工艺为发酵时间12 d、发酵温度24 ℃、发酵液初始糖度22°Bx、初始pH4.0。在此优化工艺条件下，酿得的果酒色泽呈浅黄色、澄清透亮，滋味清爽、酒体丰满，带酸甜口感，有浓郁的沙果果香和醇厚的酒香，酒精度为11.8%vol，感官评分为95.1分。沙果果酒可有效保存沙果中的多酚物质，具有清除DPPH自由基能力，反映其具有较好的抗氧化活性。
[1]王丽丽，宝音·德力格尔.沙果的研究进展[J].农产品加工，2015（10）：61-62.
[2]AZIZ M,ANWAR M,UDDIN Z,et al.Nutrition comparison between genus of apple(Malus sylvestris and Malus domestica)to show which cultivar is best for the province of Balochistan[J].J Asian Sci Res,2013,3(4):417-424.
[3]李华，赵进红，张继亮，等.不同品种沙果果实品质评价[J].林业科技开发，2012，26（6）：36-39.
[4]贾婉璐，贾建，张璇，等.沙果果醋醋酸发酵工艺条件影响因素的分析[J].食品工业，2015，36（4）：172-175.
[5]GÓRNAS′ P,MIŠINA I,OLŠTEINE A,et al.Phenolic compounds in different fruit parts of crab apple:Dihydrochalcones as promising quality markers of industrial apple pomace by-products[J].Ind Crop Prod,2015,74:607-612.
[6]YOSHIZAWA Y,SAKURAI K,KAWAII S,et al.Antiproliferative and antioxidant properties of crabapple juices[J].Food Sci Technol Res,2007,10(3):278-281.
[7]朱丹，牛广财，蔡亚平，等.沙果渣多酚抗氧化活性的研究[J].中国食品添加剂，2010（5）：129-132.
[8]李殿军，宋景荣，王桂玲，等.呼伦贝尔市沙果产业现状及发展对策[J].北方果树，2017（4）：43-45.
[9]黄琼，何燕萍.青提果酒酿造工艺的研究[J].食品研究与开发，2017，38（1）：95-98.
[10]付勋.玫瑰香橙果酒调配工艺研究[J].中国酿造，2018，37（5）：173-176.
[11]蔡文超，单春会，杨丽萍，等.红枣复合甜酒的发酵工艺初探[J].中国酿造，2018，37（6）：199-204.
[12]徐荣，胡小静，郭刚军，等.诺丽果酒酿造工艺的研究[J].食品工业，2018，39（2）：15-18.
[13]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.225—2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京：中国标准出版社，2017.
[14]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中国标准出版社，2006.
[15]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.2—2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2016.
[16]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.3—2016 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数[S].北京：中国标准出版社，2016.
[17]YU Y,XU Y,WU J,et al.Effect of ultra-high pressure homogenisation processing on phenolic compounds,antioxidant capacity and anti-glucosidase of mulberry juice[J].Food Chem,2014,153:114-120.
[18]王毓宁，李鹏霞，胡花丽，等.Folin-酚法测定水蜜桃果酒中总多酚[J].酿酒，2012，39（5）：60-62.
[19]CARMONA-JIMÉNEZ Y,GARCÍA-MORENO M V,IGARTUBURU J M,et al.Simplification of the DPPH assay for estimating the antioxidant activity of wine and wine by-products[J].Food Chem,2014,165:198-204.
[20]王杰，杨海滨，张莹，等.茶酒稳定性及抗氧化特性分析[J].食品与发酵工业，2018，44（6）：158-163.
[21]刘龙海，李新圃，杨峰，等.酿酒酵母菌生长特性的研究[J].中国草食动物科学，2016，36（3）：38-41.