豆豉为我国传统大豆发酵食品，具有较高的营养价值和食疗作用，通常是在自然条件下由多菌种混合发酵制得，因生产环境、辅料及制备工艺等不同，制得的豆豉风味和生理活性物质含量也不尽相同[1-3]。中药淡豆豉是大豆与青蒿、桑叶或紫苏、麻黄等经发酵加工制成，因发酵时加入不同药材而产生不同的药性[4-5]。豆豉和中药淡豆豉中均含有豆豉纤溶酶，能有效溶解血栓并抑制血栓形成，且安全无毒副作用[6-7]。
心脑血管疾病患者常伴有气虚血瘀，因此溶栓的同时需兼顾补气，而人参（Panax ginseng C.A.Mey.）为首选的补气中药，常用于气血两虚证，既能补气以行血，又有一定的活血之功，可用治血脉瘀滞诸证[8]。另外，卫生部2012年第17号公告已批准人参（人工种植）为新资源食品，并规定了人参的食用量，为人参在食疗产品的应用提供依据。另据报道，一些人参皂苷成分口服生物利用度低，需经肠道微生物转化为次级苷或苷元而发挥更强的药理作用[9-10]，已有学者在体外利用微生物发酵实现人参皂苷的生物转化[11-12]。
目前，尚鲜见在豆豉的制备中加入人参的相关报道，本研究以人参和黄豆为发酵基质，利用从淡豆豉中分离筛选的优势菌种纯种发酵制备人参豆豉（参豉），以期增加豆豉的益气活血作用，并实现人参皂苷的体外生物转化，提高生物利用度。以纤溶酶活性为评价指标，通过发酵菌株、人参与黄豆的质量比、人参的加入方式、发酵温度及发酵时间的考察以确定参豉的最佳发酵工艺，并利用薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）及高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析发酵前后人参皂苷的变化，为参豉作为食疗产品的应用及质量标准的建立提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
黄豆：由黑龙江省农业科学院提供，2017年种植采收，为豆科植物大豆[Glycine max（Linn.）Merr]的干燥成熟种子。人参：由吉林省百济堂参业有限公司提供，种植5年，2017年采收，为五加科植物人参的干燥根。
1.1.2 菌种
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DC-1、伞枝梨头霉（Absidia corymbifera）DC-11：分离自淡豆豉饮片（黑龙江产地和山东产地），保存至黑龙江省中医药科学院中药所生物工程研究室；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GB-1、GB-2、GB-3、GB-4（标准菌株）：中国工业微生物菌种保藏中心。
1.1.3 试剂
人参皂苷对照品Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rck（纯度均≥98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、琼脂粉（生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；尿激酶标准品、纤维蛋白原、凝血酶原：中国食品药品检定研究院；薄层硅胶G：青岛海洋化工有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱级）：美国TTEDIA试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DL-CJ-2N净化工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；MF3多功能一体机：杭州迅数科技有限公司；DHP-9272恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；e2695-2489高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Waters公司。
1.3 方法
1.3.1 参豉发酵工艺
将黄豆按照1∶1.2（g∶g）的比例加蒸馏水（或人参提取液）浸泡，待溶液吸尽，装袋，于121 ℃高压灭菌40 min，室温放置，作为发酵基质。按照2%（V/V）的接种量接种各发酵菌液（106～108 CFU/mL），摇匀，培养，即得参豉发酵产品。
1.3.2 参豉发酵工艺优选
以纤溶酶活性为评价指标，考察不同菌株、黄豆与人参比例、人参加入方式、发酵温度及发酵时间对纤溶酶活性的影响，确定最优发酵工艺。
发酵菌株的筛选：黄豆与人参比例为10∶1（g∶g），人参加水提取，将菌株DC-1、GB-1、GB-2、GB-3、GB-4、DC-11和DC-1+DC-11复合菌分别作为发酵菌，其中菌株DC-1、GB-1、GB-2、GB-3、GB-4于37 ℃条件下恒温培养48 h；菌株DC-11和DC1+DC11复合菌于28 ℃条件下恒温培养120 h。
黄豆与人参比例的考察：调整黄豆与人参质量比分别为50∶0、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1作为发酵基质，人参加水提取，以菌株DC-1为发酵菌，于37 ℃条件下恒温培养48 h。
人参加入方式的考察：黄豆与人参的比例10∶1，人参以3种方式加入：（1）将黄豆加水浸泡后沥干加入人参粉末拌匀；（2）将人参加蒸馏水煎煮2次，每次1 h，滤液浸泡黄豆；（3）先将人参用体积分数70%乙醇回流提取1 h，滤液回收乙醇，滤渣再加蒸馏水煎煮1 h，合并两次滤液浸泡黄豆。以菌株DC-1为发酵菌，于37 ℃条件下恒温培养，分别在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h取样，测定纤溶酶活性。
发酵温度的考察：黄豆与人参质量比10∶1，人参加水提取，以菌株DC-1为发酵菌，分别于25 ℃、28 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃条件下恒温培养96 h，测定纤溶酶活性。
1.3.3 纤溶酶活性的测定
参照王萍等[13]纤溶酶活性的测定方法制备纤维蛋白原平板和配制酶活力分别为80 IU/mL、60 IU/mL、40 IU/mL、20 IU/mL、10 IU/mL的尿激酶标准溶液。取2 g样品加0.9%氯化钠溶液10 mL，研磨、过滤，分别取各样品滤液及尿激酶标准溶液各10 μL，点于纤维蛋白平板上，于37 ℃温育18 h，测定溶圈面积。以尿激酶溶圈面积（y）为纵坐标，酶活力（x）为横坐标，绘制尿激酶标准曲线（y=1.722 1x+9.255 9，R2=0.9906），根据标准曲线回归方程计算样品的纤溶酶活性。
1.3.4 薄层色谱分析
供试品溶液的制备：参照《中国药典》并稍作修改[4]。取最优发酵工艺制备的参豉样品干燥、粉碎，过3号筛，取10 g粉末（10 g参豉样品相当于含1 g人参），以同法处理的未接种发酵基质为对照，分别加入三氯甲烷40 mL，加热回流3 h，过滤，药渣挥干溶剂，加水饱和的正丁醇50 mL，超声处理30 min，过滤。滤液加3倍体积的氨试液，摇匀，放置分层，收集上层溶液并蒸干，加入1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷对照品Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rck，加甲醇，分别制成质量浓度为2 g/L的对照品混合溶液。
采用薄层色谱法[4]，吸取上述人参皂苷对照品溶液和供试品溶液各2 μL，分别点于同一薄层硅胶G板。以10 ℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，V/V）下层溶液为展开剂，于4 ℃展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热至斑点显色清晰，置于紫外光灯（365 nm）下观察。
1.3.5 高效液相色谱分析
参照《中国药典》对参豉中人参皂苷进行定量分析[4]。采用甲醇将1.3.4中的对照品混合溶液稀释10倍，得到质量浓度为0.2 g/L的对照品溶液。以未接种发酵基质为对照，取最优发酵工艺制备的参豉样品粉末10 g进行HPLC分析。HPLC条件：C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）和水（B），洗脱梯度为0～35 min，A为19%；35～55 min，A为19%～29%；55～70 min，A为29%；70～110 min，A为29%～40%。流速1 mL/min，检测波长203 nm。
1.3.6 数据分析
采用Graphpad Prism 6.0软件进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 参豉发酵工艺的确定
2.1.1 发酵菌株的筛选
不同发酵菌株对参豉纤溶酶活力的影响见图1。
图1 不同菌株对参豉纤溶酶活性的影响
Fig.1 Effect of different strains on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi
由图1可知，不同菌株发酵参豉的纤溶酶活性大小排序为菌株DC-1＞GB-1＞DC-11+DC-11＞GB-3＞GB-2＞GB-4＞DC-11，其中枯草芽孢杆菌DC-1发酵参豉的纤溶酶活性最高，为（478.95±3.50）IU/g。已有研究表明，枯草芽孢杆菌为豆豉的主发酵菌，也是产豆豉纤溶酶的主要菌[14]。菌株DC-1和GB-1、GB-2、GB-3、GB-4虽均为枯草芽孢杆菌，但纤溶酶活性明显存在差异（P＜0.05），说明同一菌种不同菌株产纤溶酶能力存在差异。菌株DC-11为伞枝梨头霉，在酒曲中普遍存在，可改善酒的风味和口感[15]，该菌已用于人参皂苷、黄芪皂苷的微生物转化[16-17]。由于淡豆豉传统自然发酵为多菌种混合发酵而成，菌株DC-1和DC-11均分离自淡豆豉饮片，因此本研究中也利用这两种菌复合菌发酵制备参豉进行对比研究。结果表明，最佳发酵菌株为DC-1。
2.1.2 黄豆与人参比例的确定
黄豆与人参比例对参豉纤溶酶活力的影响见图2。
图2 黄豆与人参比例对参豉纤溶酶活性的影响
Fig.2 Effect of soybean to ginseng ratio on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi
由图2可知，随着人参加入量的升高，参豉纤溶酶活性呈现先升高后降低的趋势，当黄豆与人参比例为10∶1（g∶g）时，纤溶酶活性最高，为（495.02±19.24）IU/g。分析原因可能是人参在低质量浓度时促进而高质量浓度时抑制菌株DC-1的生长，进而影响纤溶酶活性。因此，确定黄豆与人参最佳比例为10∶1（g∶g）。
2.1.3 人参添加方式及发酵时间的确定
人参添加方式及发酵时间对参豉纤溶酶活力的影响见图3。
图3 人参添加方式及发酵时间对参豉纤溶酶活性的影响
Fig.3 Effect of ginseng addition mode and fermentation time on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi
由图3可知，人参以水提液和先醇提再水提的方式加入后发酵96 h时，纤溶酶活性均达到最高，分别为（492.95±36.25）IU/g和（498.07±35.12）IU/g，且优于以粉末形式加入，从工艺过程考虑，人参采用水提液方式加入，发酵时间96 h。
2.1.4 发酵温度的确定
发酵温度对参豉纤溶酶活力的影响见图4。
图4 发酵温度对参豉纤溶酶活性的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi
由图4可知，发酵温度为25 ℃时，纤溶酶活力较低，分析原因可能是该菌生长比较缓慢所致；发酵温度为28 ℃时，参豉纤溶酶活性最高，为（498.90±28.33）IU/g；发酵温度高于28 ℃之后，纤溶酶活性呈下降趋势，40 ℃时下降明显，表明DC-1菌的生长受温度的影响较大，进而影响酶的生物量。
综上所述，以纤溶酶活性为考察指标，确定参豉最佳发酵工艺：优势发酵菌株为枯草芽孢杆菌DC-1，黄豆与人参比例为10∶1（g∶g），人参以水提液的方式加入，于28 ℃发酵96 h。
2.2 薄层色谱分析结果
《中国药典》中仅以Rg1、Rf、Re、Rb1为对照进行人参的鉴别[4]，本研究增加了稀有人参皂苷Rck、Rh1和Rc为对照品，为分析人参皂苷多种成分的转化提供依据。7种人参皂苷的薄层色谱分析结果见图5。
图5 参豉中人参皂苷薄层色谱分析结果
Fig.5 Result of ginsenoside in ginseng-Douchi analyzed by thin layer chromatogram
由图5可知，7种人参皂苷对照品薄层色谱斑点分离度较好，表明该方法适用于这7种人参皂苷的分离。参豉发酵前后均含有7种人参皂苷，但发酵后人参皂苷Rh1和Rf斑点颜色变淡，可能是由于这两种成分发生了生物转化。参豉发酵前后样品的在Rc和Rb1斑点较密集，没有明显分开，可能是由于大豆中的成分干扰所致，需结合高效液相色谱结果进一步分析。
2.3 高效液相色谱结果
发酵前后参豉的HPLC见图6，7种人参皂苷含量的变化见表1。
由图6可知，除人参皂苷Rck在此色谱条件下未显示单一的色谱峰外，其他6种人参皂苷对照品分离度均较好。由表1可知，未接种基质中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1和Rc的含量分别为0.185 2 mg/g、0.355 8 mg/g、0119 8 mg/g、0.116 0 mg/g、0.071 6 mg/g和0.585 7 mg/g，发酵后分别为0.050 0 mg/g、0.095 5 mg/g、0.043 3 mg/g、0.039 0 mg/g、0.024 0 mg/g和0.156 0 mg/g，发酵后6种人参皂苷成分均下降60%以上，表明这6种成分在微生物酶作用下发生了生物转化。未接种基质在38.29 min出现一个色谱峰，但发酵后消失，且在36.98 min出现了一个新化合物，可能是此种成分转化而得。除6种人参皂苷外，在80 min后也有几种物质峰面积下降，可能是其他人参皂苷成分发生了降解。目前已经从人参属植物中分离得到150多种人参皂苷[18]，《中国药典》仅以人参皂苷Rg1、Re、Rb1三种对照品测定其含量，本研究又增加了Rf、Rh1和Rc对照品，但仍存在一定局限性，因为不同人参皂苷的结构不同，不能采用同一种方法把所有人参皂苷都提取分离并检测出来。
图6 人参皂苷对照品（A）及发酵前后参豉样品（B）的高效液相色谱图
Fig.6 HPLC of ginsenoside reference substance (A) and ginseng-Douchi (B) before and after fermentation
表1 参豉发酵前后6种人参皂苷含量的变化
Table 1 Changes of 6 kinds of ginsenoside in ginseng-Douchi before and after fermentation
在已有报道中，人参皂苷的生物转化多以一种或几种人参皂苷单体成分进行转化[19-20]，不受其他基质成分的干扰，更易于转化成分的分析。参豉中人参的加入量仅为黄豆质量的1/10，在样品制备及检测过程中可能受黄豆中的一些成分干扰，且人参以水提液的方式加入，使人参皂苷成分不能完全提取出来，分析转化产物的成分相对也比较复杂。人参水提液中除含有人参皂苷外，人参多糖在降糖、增强免疫、抗氧化等方面也发挥了重要作用[21-22]。经典名方“独参汤”是以水煎液口服入药，ZHOU S S等[23]研究表明，独参汤可通过人参多糖对肠道菌群的调节作用促进人参皂苷的转化；李瑞刚等[24]研究也证实人参多糖能促进人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1。本研究仅基于6种人参皂苷成分对参豉发酵前后人参皂苷的含量变化进行分析，对于其他人参皂苷的转化情况尚需通过大量的实验进一步研究。
3 结论
本研究利用淡豆豉的发酵原理，将黄豆辅以人参发酵制备一种具有高纤溶活性的参豉。通过发酵菌株的筛选、人参的加入量和加入方式、发酵温度及发酵时间的考察确定了参豉的最佳发酵工艺：优势发酵菌株为枯草芽孢杆菌DC-1，黄豆与人参比例为10∶1（g∶g），人参以水提液的方式加入，于28 ℃发酵96 h。此优化条件下参豉的纤溶酶活力达到（498.90±28.33）IU/g。同时，通过微生物发酵实现了多种人参皂苷的体外生物转化，转化率达60%以上。本研究为参豉后续益气活血作用研究及质量标准建立提供依据，也为开发具有保健作用的食疗产品奠定基础。
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