窖泥是固态浓香型白酒产酸呈味、产酯生香等微生物的栖息地，是酿造白酒风味的基础[1-2]，富集了种类繁多、功能各异的酿酒微生物菌群[3-4]。有研究发现，老窖中厌氧型细菌的种类及数量均多于新窖[5]，这些细菌对白酒中香味物质的形成起着重要作用，是老窖产好酒的重要原因[6]。己酸菌是重要的窖泥产酸功能菌，其代谢产生的己酸与大曲发酵产生的乙醇生成己酸乙酯[7-8]，形成浓香型大曲酒的主体香成分，决定着浓香型白酒的质量及风格[9]。己酸菌的细胞形态有梭状、短杆状或长杆状，分为专性厌氧、耐氧性和好氧性菌[10]。
1964年，轻工部茅台试点组从窖泥中成功筛选出了己酸菌[11]，在此研究基础上，1975年，内蒙古轻工所采用纯培养的方法也从老窖泥中筛选出了己酸菌，同时对己酸菌的培养方法进行了研究[12]。在己酸菌的生理代谢研究方面：沈怡方[13]经过一系列试验后发现，当培养基中缺乏乙醇时，易使丁酸的含量增加，若在培养基中增加淀粉类碳源时，易使己酸的含量降低，丁酸含量增加。在己酸菌培养的改进方面：杜礼泉等[14]使用不锈钢罐培养、改进了培养基成分（去掉了钙类物质）；娄虹等[15]采用了固定化方法培养己酸菌；王瑞明等[16]采用絮凝技术提高了培养液中己酸菌的数量。杜礼泉等[17]解决了己酸菌在培养过程中发臭、变黑的问题。目前大多数酒厂多应用窖泥富集菌液改善酒质，但在突出浓香型白酒的呈香风格上效果不明显[13，18]，因此筛选出高产己酸的菌株具有极其重要的意义。
本研究通过对老窖泥多次富集培养从中筛选高产己酸的菌株，通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定，并对其中己酸生产能力最佳的一株己酸菌的发酵性能进行研究，为进一步的生产应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
老窖泥（1#、2#、3#）：某老酒厂优质大曲酒发酵池。
1.1.2 培养基
乙醇醋酸钠培养基[19]：乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.05%，酵母膏0.1%，调节pH至7.0，121 ℃高压蒸气灭菌20 min，接种前加入无水乙醇2%。
平板筛选培养基[11]：乙酸钠0.5%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，硫酸铵0.05%，酵母膏0.1%，调节pH至7.0，121 ℃高压蒸气灭菌20 min，接种前加入碳酸钙0.5%，无水乙醇2%以及0.1%溴百里酚蓝指示剂1%。
1.1.3 试剂
细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-ZFD双人单面洁净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；MJX-250C立式恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备有限公司；LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；ALC-1104电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；Agilent6820气相色谱（gaschromatography，GC）仪：美国安捷伦公司；DHG-9071A电热恒温干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；722E可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；LEICA电子显微镜：德国LEICA公司；DK-98-II双列八孔电热恒温水浴锅：天津市泰斯特有限公司；C1000 Touch聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国伯乐公司。
1.3 实验方法
1.3.1 富集培养
称取某酒厂优质窖泥10 g于90 mL无菌水中，内含有无菌玻璃珠，振荡，使窖泥分散均匀成悬液。将样品悬液在80 ℃水浴30 min，杀灭营养体及其他杂菌，富集芽孢。吸取热处理后的悬液，以10%（V/V）的接种量加入乙醇醋酸钠培养基中，装液量为200 mL，于37 ℃条件下培养7 d，连续富集4次后分别测定己酸含量。
1.3.2 产己酸菌的分离筛选
选取富集液中己酸含量最高的样品梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，将稀释后的菌悬液分别涂于平板筛选培养基上，每个梯度做三组平行，用封口膜封口后倒置于37 ℃培养箱中恒温培养3 d，筛选出黄色或黄绿色菌落。采用三区划线法对得到的黄色菌落进行纯化，得到单菌落[11]。
1.3.3 产己酸菌的鉴定
（1）形态观察及己酸生产鉴定
对分离纯化后得到的菌株进行形态观察[13]，将菌株接种于乙醇醋酸钠培养基中，于37 ℃条件下培养7 d后，利用气相色谱法测定己酸含量，以鉴别是否属于己酸菌。
（2）分子生物学鉴定
挑取单菌落于乙醇醋酸钠培养基中，37 ℃条件下培养3 d，10 000 r/min高速离心1 min，收集菌体沉淀。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，以其为模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR扩增细菌16SrDNA序列。PCR扩增体系：10×ExTaqbuffer2.0μL，ExTaq酶（5U）0.2 μL，2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix 1.6μL，上下游引物各1 μL，模板0.5 μL，双蒸水（ddH2O）13.7 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共25个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至美吉生物公司测序，将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank数据库中进行同源性比对。
1.3.4 高产己酸菌发酵性能测试
生长曲线：将种子液（制备方法同1.3.1）按10%接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中，37 ℃条件下恒温培养，每隔8～10 h取样，采用可见分光光度计测定其OD600nm值，以未接种的培养基为空白样，每个样品重复三次。
发酵时间对菌株产己酸的影响：将种子液按10%接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中，37 ℃条件下恒温培养，每隔24 h取5 mL样品，测定己酸含量，每个样品重复三次。
初始pH值对菌株产己酸的影响：调节乙醇醋酸钠培养基的初始pH值为pH 2.0～12.0共11个梯度，将种子液按10%的接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中，37 ℃条件下恒温培养7 d，测定己酸含量，每个样品重复三次。
乙醇对菌株产己酸的影响：在乙醇醋酸钠培养基中分别加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的无水乙醇，将种子液按10%的接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中，37 ℃条件下恒温培养7 d，测定己酸的含量，每个样品重复三次。
发酵温度对菌株产己酸的影响：将种子液按10%的接种量接种于乙醇醋酸钠培养基中，分别在11～57 ℃（梯度为2 ℃）条件下培养7 d，测定己酸的含量，每个样品重复三次。
1.3.5 己酸的测定
采用GC法测定己酸含量[20]。色谱柱为FFAP白酒分析专用色谱柱（50 m×0.25 mm×0.5 μm）；程序升温：初始温度47 ℃，保持5 min，以4.5 ℃/min的速率升温至70 ℃，再以5 ℃/min的速率升温至98 ℃，维持1 min，以5 ℃/min的速率升温至145 ℃，以5 ℃/min的速率升温至190 ℃，以10 ℃/min的速率升温至230 ℃，保持15 min；汽化室温度250 ℃；检测器温度250 ℃；载气为高纯氮气（N2），流速：3 mL/min；进样量0.6 μL；分流比为1∶1。
2 结果与分析
2.1 老窖泥的富集培养
将老窖泥1#、2#、3#分别连续富集4次后，测定己酸含量，结果见图1。
图1 1#（A）、2#（B）及3#（C）老窖泥富集液中己酸含量
Fig.1 Caproic acid content in enriched aged pit mud 1#(A)、2#(B) and 3#(C)
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，在相同培养基成分及培养条件下，3#老窖泥的己酸含量远高于1#老窖泥和2#老窖泥，且随着富集次数的增加，己酸含量增加，产己酸的稳定性好，产酸能力强，故选择3#老窖泥富集液作为筛选优质高产己酸菌的菌源。
2.2 产己酸菌的筛选
通过平板筛选培养基筛选出3株产己酸细菌，编号为A-1、A-3、A-5，其形态观察结果见图2，具体描述见表1及表2。
由图2、表1及表2可知，菌株A-1、A-3及A-5符合己酸菌的基本形态[5]，菌落呈白色圆形扁平状，表面湿润光滑，边缘较规则，细胞形态呈杆状，芽孢端生或近端生。
图2 菌株A-1、A-3及A-5菌落形态（A、B、C）及细胞形态（D、E、F）
Fig.2 Colony (A,B,C) and Cell (D,E,F) morphology of A-1，A-3 and A-5
表1 菌株的菌落形态
Table 1 Colony morphology of strains
表2 菌株的细胞形态
Table 2 Cell morphology of strains
注：“+”表示结果呈阳性。
2.3 筛选菌株的己酸生产鉴定
菌株A-1、A-3、A-5的己酸产量见图3。由图3可知，菌株A-1、A-3、A-5均能产己酸，且产量较高，分别为5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L，将其作为高产己酸菌进行进一步研究。
图3 菌株A-1、A-2及A-3的己酸产量
Fig.3 Caproic acid yield of strains A-1,A-2 and A-3
2.4 高产己酸菌的分子生物学鉴定
2.4.1 PCR扩增结果
菌株A-1、A-3及A-5的16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果见图4。由图4可知，菌株A-1、A-3及A-5的16S rDNA的PCR扩增产物碱基长度约为1 600 bp，与预期结果相符，送至美吉生物公司测序。
图4 菌株A-1、A-2及A-3 16S rDNA PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig.4 Agarose gel electrophoresis result of PCR products of 16S rDNA of strains A-1,A-2 and A-3
M：DL2000 Marker；1：菌株A-1；2：菌株A-3；3：菌株A-5。
2.4.2 同源性比对结果
将菌株A-1、A-3、A-5的测序结果在Genbank数据库中进行Blast比对分析，结果见表3。
表3 序列同源性比对结果
Table 3 Results of sequence homologous alignment
由表3可知，3株菌株与克鲁维氏梭菌的同源性＞98%，表明3株菌均为克鲁维氏梭菌（Clostridium kluyveri），根据己酸生产性能，选取己酸生产能力最高的菌株A-3进行发酵性能测试。
2.5 菌株A-3发酵性能测试结果
2.5.1 生长曲线
图5 菌株A-3的生长曲线
Fig.5 Growth curve of strain A-3
菌株A-3的生长曲线见图5。由图5可知，菌株A-3的延迟期为0～22 h，对数生长期为22～80 h，80 h后进入稳定期。
2.5.2 发酵时间对菌株A-3产己酸的影响
发酵时间对菌株A-3产己酸的影响见图6。由图6可知，发酵过程中，菌株A-3的己酸产量呈先升高后趋于稳定的趋势。发酵1～2 d时，己酸含量无明显变化；发酵3～7 d，己酸含量明显升高，己酸含量从1.44 g/L增加至6.10 g/L；发酵8～14 d，己酸含量从6.10 g/L增加至6.71 g/L，变化较小；发酵14 d后，己酸产量趋于稳定，终止发酵。
图6 发酵时间对菌株A-3产己酸的影响
Fig.6 Effect of fermentation on caproic acid production by strain A-3
2.5.3 初始pH值对菌株A-3产己酸的影响
初始pH值对菌株A-3产己酸的影响见图7。由图7可知，随着培养基初始pH值的升高，菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趋势。当初始pH值为7.0时，己酸含量最高，为7.79 g/L，故菌株A-3产己酸的最适pH值为7.0，pH耐受范围为3.0～11.0。
图7 初始pH值对菌株A-3产己酸的影响
Fig.7 Effect of initial pH on caproic acid production by strain A-3
2.5.4 乙醇对菌株A-3产己酸的影响
乙醇对菌株A-3产己酸的影响见图8。由图8可知，随着乙醇含量的增大，菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趋势。当培养基中乙醇含量为2%时，己酸含量最高，为6.22 g/L。不添加乙醇时，菌株A-3不产己酸，表明乙醇是产己酸的必要条件之一。乙醇含量过高，对己酸菌有一定的抑制作用，其己酸含量显著下降（P＜0.05）。当乙醇含量为6%时，发酵液中几乎检测不出己酸。故菌株A-3的最适乙醇含量为2%，乙醇最高耐受度为5%。
图8 乙醇对菌株A-3产己酸的影响
Fig.8 Effect of ethanol on caproic acid production by strain A-3
2.5.5 发酵温度对菌株A-3产己酸的影响
发酵温度对菌株A-3产己酸的影响见图9。由图9可知，随着发酵温度的升高，菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趋势。当发酵温度为37 ℃时，己酸含量最高，为8.17 g/L。当发酵温度低于11 ℃或高于57 ℃时，则几乎不产己酸，故最适发酵温度为37 ℃，温度耐受范围为13～55 ℃。
图9 发酵温度对菌株A-3产己酸的影响
Fig.9 Effect of fermentation temperature on caproic acid production by strain A-3
3 结论
通过对老窖泥的多次富集培养，从3#老窖泥中筛选得到3株高产己酸的菌株A-1、A-3和A-5，己酸产量分别为5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L。通过形态观察及分子生物学技术鉴定3株菌株均为克鲁维氏梭菌（Clostridium kluyveri）。其中Clostridium kluyveri A-3己酸产量最高，对其发酵性能进行测定。结果表明，Clostridium kluyveri A-3在22 h后进入对数期，80 h后进入稳定期，其产己酸的最佳初始pH值为7.0，发酵时间为14 d，发酵温度为37 ℃，乙醇含量为2%，pH耐受范围为3.0～11.0，乙醇最高耐受含量为5%，温度耐受范围为13～55 ℃。通过对高产己酸A-3菌株发酵性能的研究发现，其产酸性能极佳，发酵性能良好，可为进一步的生产应用奠定基础。
[1]XIAO Z,YU D,NIU Y,et al.Characterization of aroma compounds of Chinese famous liquors by gas chromatography-mass spectrometry and flash GC electronic-nose[J].J Chromatogr B,2013,50(14):945-946.
[2]FAN W,QIAN M C.Characterization of aroma compounds of Chinese Wuliangye and Jiannanchun liquors by aroma extract dilution analysis[J].J Agr Food Chem,2006,54(7):2695-2704.
[3]杨菁瑾，唐雪，杨先超，等.泸州老窖不同窖龄窖泥中己酸菌遗传多样性及系统发育[J].四川农业大学学报，2015，33（2）：181-188.
[4]赵辉，敞颜，王葳，等.浓香型白酒窖泥中高产己酸兼性厌氧细菌的分离鉴定[J].食品科学，2012，33（5）：177-182.
[5]KIM B-C,JEON B S,KIM S-I K,et al. Caproiciproducens galactitolivorans gen.nov.,sp.nov.,a bacterium capable of producing caproic acid from galactitol,isolated from a wastewater treatment plant[J].Int J Syst Evol Micr,2015,65(12):34-35.
[6]徐泽江.芝麻香型白酒酿造微生物多样性分析[D].杭州：浙江理工大学，2012.
[7]YUAN H W,TAN L,CHEN H,et al.Vinegar production from post-distillation slurry deriving from rice,shochu,production with the addition of caproic acid-producing bacteria consortium and lactic acid bacterium[J].J Biosci Bioeng,2017,124(6):653-659.
[8]KENEALY W R,CAO Y,WEIMER P J.Production of caproic acid by cocultures of ruminal cellulolytic bacteria and Clostridium kluyveri grown on cellulose and ethanol[J].Appl Microbiol Biot,1995,44(3):208-213.
[9]谭光迅，李净，张明，等.无泥窖浓香白酒的生产研究[J].酿酒，2013，40（3）：65-69.
[10]敞颜.浓香型白酒窖泥中高产己酸细菌的筛选及液体窖泥制备[D].哈尔滨：黑龙江大学，2011.
[11]万朕.窖泥功能菌筛选及DYH-1 养窖液的应用研究[D].武汉：湖北工业大学，2011.
[12]黄治国，刘燕梅，卫春会，等.基于PCR-DGGE 的浓香型白酒窖泥细菌群落结构研究[J].西南大学学报（自然科学版），2014，36（8）：167-172.
[13]沈怡方.关于己酸菌的培养及其应用[J].酿酒科技，1998（4）：7-15.
[14]杜礼泉，古加强，康聪，等.己酸菌、液体窖泥的发酵罐混合培养及应用的进一步研究[J].酿酒，2004（1）：31-33.
[15]娄虹，刘宏生，朱世瑛.固定化己酸菌连续发酵的研究[J].酿酒，1997（5）：11-12.
[16]王瑞明，贾士儒.己酸菌细胞分离及保活脱水技术的初步研究[J].工业微生物，2002，32（1）：40-42.
[17]杜礼泉，唐聪，杨徐才，等.己酸菌培养过程中变黑、发臭原因的探析[J].酿酒，2003（3）：14-15.
[18]刘雪，杨爱华，曹建全，等.己酸菌的分离筛选及发酵条件优化[J].酿酒，2016，43（6）：37-40.
[19]黄莹娜.枝江大曲酒窖泥微生物群落结构与多样性分析[D].武汉：华中农业大学，2016.
[20]杨珍，贺立东.反吹-气相色谱法快速检测啤酒中的主要风味物质[J].中国酿造，2019，38（10）：171-174.