银杏（Ginkgo biloba L.）为银杏科、银杏属落叶乔木，素有“活化石”和“植物界熊猫”之称[1]。其早在明朝初年就有入药的记载，《本草纲目》记载银杏具有“入肺经、益脾气、定喘咳、缩小便”功效。现代医学对银杏提取物特别是银杏叶提取物进行大量研究发现，该提取物对心脑血管疾病等具有非常显著的疗效[2]，进一步研究发现其主要成分为萜内酯类化合物和黄酮类化合物[3]。但银杏提取物中黄酮的含量很低，提取难度大、成本高，很难满足日益增长的市场需求[4]。
近年来，对植物内生真菌的研究越来越多，研究成果日益受到重视[5]。植物内生真菌指生活史的部分或全部时间生存在健康植物体内，对宿主植物无害的真菌[6-7]。由于内生真菌和药用植物协同进化，内生真菌可以在生命活动过程中合成某些药用植物所具有的相同或相似的物质[8]。内生菌具有数量众多、群结构多样的特点，是潜力巨大的微生物新资源[9-10]。采用银杏内生真菌发酵生产银杏黄酮，既可以大大增加银杏黄酮的产量又可以很好的保护银杏资源。因此，有望通过银杏内生真菌发酵产生大量银杏黄酮。目前，对银杏内生真菌产黄酮的研究主要集中在对产生菌的分离鉴定的研究，如赵庆云等[11]利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）-紫外（ultraviolet，UV）的方法从银杏内生菌中筛选出8株具有产黄酮能力的内生菌，其中7株为真菌，1株为放线菌。然而，对银杏内生菌产黄酮发酵工艺研究较少，张洋等[1]对产黄酮银杏内共生真菌进行分离并对其发酵条件进行优化，研究菌发酵7 d黄酮产量可达6.4 μg/mL。
本研究以前期从银杏叶中分离出的一株产黄酮能力较强的内共生真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017为研究对象，总黄酮产量为响应值，采用单因素试验及响应面法优化其产黄酮的发酵工艺条件，以期提高银杏黄酮产量，为规模化生产提供了理论和实践的基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017：实验室保藏菌种。
1.1.2 试剂
麦精：山东天骄生物技术有限公司；玉米浆：金克隆（北京）生物技术有限公司；麦芽糖、糊精（均为分析纯）：广州亿源生物科技科技有限公司；蛋白胨（分析纯）：广州西楚生物技术有限公司；NaNO3、K2HPO4、KCl、FeSO4（均为分析纯）：山东嘉颖华工科技有限公司；琼脂粉（生化试剂）：合肥博美生物科技有限公司；消泡剂（食品级）：上海海域化工有限公司。
1.1.3 培养基
斜面培养基[12]：麦芽糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，NaNO31.0 g/L，FeSO40.01 g/L，K2HPO40.05 g/L，琼脂粉18 g/L。121 ℃高压灭菌20 min。
种子培养基[13]：玉米浆8 g/L，糊精40 g/L，NaNO31.0 g/L，KCl 0.5 g/L，消泡剂0.1 g/L。121 ℃高压灭菌20 min。
发酵培养基[14]：麦精60g/L，玉米浆15g/L，消泡剂0.1 g/L。121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
VD-850台式超净工作台：杭州旭清科技有限公司；LHPYX3M生化培养箱：常州金南仪器制造有限公司；HNY-200B恒温摇床：上海乔跃电子科技有限公司；FC-ZD-20 L机械搅拌通风式发酵罐：武汉金榜轻工机械设备有限公司；TDZ4离心机：青岛诺凯达机械制造有限公司；Agilent1260型高效液相色谱仪：美国Agilent Technologies公司。
1.3 试验方法
1.3.1 卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017种子液制备
将卷枝毛霉CN2017接种于斜面培养基，于28 ℃条件下活化培养7 d。取卷枝毛霉CN2017的孢子，制备孢子悬液（1×108个/mL）。吸取2 mL孢子悬液接种于装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶，于28 ℃、210 r/min条件下培养38 h，即为种子液。
1.3.2 卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件优化单因素试验
按10%（V/V）接种量将种子液接种于20 L机械搅拌通风式发酵罐，发酵培养基装液量为14 L，初始pH值为5.5，在发酵温度28 ℃、通气量为6.0 L/min条件下培养8 d。
在此基础上，依次考察初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、发酵温度（26 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃）、接种量（8%、9%、10%、11%、12%、13%）和通气量（3.0 L/min、4.0L/min、5.0L/min、6.0L/min、7.0 L/min、8.0 L/min）对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响。
1.3.3 卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取初始pH值（X1）、发酵温度（X2）、接种量（X3）、通气量（X4）为考察因素，以银杏总黄酮产量（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验水平设计[15-17]，进行4因素3水平响应面试验，因素与水平见表1。
表1 卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization of flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
1.3.4 总黄酮含量测定方法
采用氯化铝比色法测定发酵液中总黄酮含量[1，18]。
1.3.5 数据处理
采用Design Expert 8.0.6软件[19-20]对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，通过SPSS 19.0软件分析显著性（P＜0.05），所有试验均做3个重复。
2 结果与分析
2.1 卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件优化单因素试验结果
2.1.1 初始pH值对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
初始pH值对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响结果见图1。由图1可知，随着初始pH值的升高，总黄酮产量呈先升高后下降的趋势。当初始pH值为6.0时，总黄酮产量最高，为52.39 mg/L。卷枝毛霉通过一定的代谢路径产生银杏黄酮，受到一系列酶的催化影响，初始pH值过低或过高均会抑制酶的活性。因此，确定卷枝毛霉SN2017产黄酮的最适的初始pH值为6.0。
图1 初始pH值对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
Fig.1 Effect of initial pH on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
2.1.2 发酵温度对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
发酵温度对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响结果见图2。由图2可知，随着发酵温度的升高，总黄酮产量呈先升高后降低的趋势。当发酵温度为29 ℃时，总黄酮产量最高，为54.69 mg/L。分析原因可能是发酵温度过低或过高均会抑制酶的活性，进而影响黄酮产量。因此，确定卷枝毛霉SN2017产黄酮的最适发酵温度为29 ℃。
图2 发酵温度对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
2.1.3 接种量对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
接种量对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响结果见图3。由图3可知，随着接种量的增加，总黄酮产量呈先升高后下降的趋势。当接种量为11%时，总黄酮产量最高，为53.96 mg/L。
图3 接种量对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
Fig.3 Effect of inoculum on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
接种量的大小取决于菌种生长速率，接种量大可以缩短发酵时间，并减少发酵过程染菌。但如果接种量过大，会造成溶氧不足，降低发酵产量。因此，确定卷枝毛霉SN2017产黄酮的最适接种量为11%。
2.1.4 通气量对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
图4 通气量对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响
Fig.4 Effect of ventilation on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
通气量对卷枝毛霉SN2017产黄酮的影响结果见图4。由图4可知，随着通气量的增加，总黄酮产量呈先升高后降低的趋势。当通气量为6.0 L/min时，总黄酮产量最高，为54.62 mg/L。卷枝毛霉是一种好氧丝状真菌，发酵过程需要在发酵液中通入一定浓度的氧气。发酵液中溶氧会影响卷枝毛霉的酶活，过大或过小的溶氧浓度都会抑制酶的活性。因此，确定卷枝毛霉SN2017产黄酮的最适通气量为6.0 L/min。
2.2 卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件优化响应面试验结果
2.2.1 回归模型建立
在单因素试验的基础上，选取初始pH值（X1）、发酵温度（X2）、接种量（X3）、通气量（X4）为考察因素，以银杏总黄酮产量（Y）为响应值，采用Box-Behnken试验水平设计[15-17]，进行4因素3水平响应面试验，响应面试验结果与分析见表2。
表2 卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件优化Box-Behnken试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization of flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
使用统计软件Design Expert 8.0.6对表2结果进行多元回归拟合，所得二次多项式回归方程为：
2.2.2 回归模型方差分析
回归模型的方差分析结果见表3。
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
由表3可知，模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明回归模型的拟合度较好。模型的决定系数R2=0.973 8，校正决定系数R2adj=0.948 5，表明所建模型和实际情况拟合程度高，可以用于卷枝毛霉SN2017产黄酮发酵条件的预测。一次项X2、X3、X4、交互项X1X2、X1X4、X2X3、X2X4对结果影响极显著（P＜0.01）；二次项X42对结果影响显著（P＜0.05）；其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.2.3 响应面试验分析及验证试验
发酵温度、初始pH值、接种量及通气量交互作用对卷枝毛霉SN2017产黄酮影响的响应面及等高线见图5。
由图5可知，除交互项X1X3外，随着各因素水平的增大，响应值呈先升高后减小的趋势。交互项X1X2、X1X4、X2X3、X2X4对卷枝毛霉SN2017产黄酮影响的响应面均呈现抛物面，即说明4个交互项所在选取的试验范围内，响应值均存在极大值。等高线均呈椭圆形，即说明4个交互项对结果影响显著，与方差分析结果一致。
图5 各交互作用对卷枝毛霉SN2017产黄酮影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on flavonoids production by Mucor circinelloides SN2017
使用Design Expert 8.0.6软件对二次多项式回归方程求解，求得卷枝毛霉SN2017产黄酮的最优发酵工艺条件为：初始pH值5.39，发酵温度29.83 ℃、接种量9.67%、通气量6.46 L/min，预测总黄酮产量为55.0 mg/L。考虑实际操作可行性，最终确定最优发酵工艺为初始pH值5.5、发酵温度30 ℃、接种量9.7%、通气量6.5 L/min。在此最优发酵工艺条件下，总黄酮产量为56.63 mg/L，与预测值接近，说明回归模型和实际情况可以较好的拟合，总黄酮产量较优化前（52.39 mg/L）提高8.09%，比目前文献报道的最高银杏总黄酮发酵产量提高142%[18]。
3 结论
通过单因素及响应面试验优化确定银杏内共生菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017产黄酮的最优发酵工艺条件为：初始pH值5.5、发酵温度30 ℃、接种量9.7%、通气量6.5 L/min。在此最优发酵条件下，总黄酮产量为56.63 mg/L，较优化前提高8.09%。由此可见，本研究所构模型可显著提高银杏总黄酮发酵产量，为规模化生产提供了理论和实践的基础。
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