真菌毒素又称霉菌毒素，主要是一类由产毒丝状真菌产生的有毒次生代谢产物。目前，已发现了300～400种真菌毒素。在条件适宜的情况下，农作物极易受到这些真菌侵染，从而造成真菌毒素污染，威胁人畜健康。据报道，全世界超过25%的农副产品被霉菌毒素污染，其中2%的农产品因污染严重而失去营养和经济价值，从而造成数百亿美元的经济损失[1]。为了避免及最大限度降低真菌毒素的危害，在做好农产品仓储以防止霉菌滋生的同时，进行真菌毒素的检测尤为重要。国内外学者运用不同的检测技术对食品中真菌毒素的检测方法做了大量的研究。对真菌毒素的检测的研究主要集中在应用单一实验方法或分析仪器进行是单一类毒素的检测，如应用薄层分析（thinlayer chromatography，TLC）[2]、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[3-4]、毛细管电泳色谱法（capillary electrophoresis，CE）[5]和高效液相色谱法[6]（high performance liquid chromatography，HPLC）等检测不同真菌毒素。随着现代分析技术的发展和推广，越来越多的分析学者将高通量分析的仪器应用到对种真菌毒素的分析。例如气相色谱-串联质谱法[7]（gaschromatography-tandemmassspectrometer，GC-MSMS）、液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometer，LC-MS-MS）[8-9]。这些仪器既具有色谱法的高分离效率，又有质谱法定性专属性的能力，成为真菌毒素检测中的首选仪器分析方法。
这些仪器分析方法的广泛应用，还需要有效的样品前处理方法为基础，以保证最后的分析结果。目前应用于真菌毒素的提取方法包括固相萃取[10]、超临界萃取[11]、加速溶剂萃取[12]和免疫亲和柱[13]等。这些方法多数用于单一类真菌毒素的提取，针对于多种真菌毒素的分析报道较少。免疫亲和柱虽然能同时分析多种真菌毒素，但是价格昂贵，增加了分析成本。而一种新型的多种真菌毒素样品前处理方法—QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）[14-16]由于其高效、简便和环保的特点，逐渐地在真菌毒素分析检测领域得到广泛应用。利用该技术，能够有效地提取和净化基质中多种真菌毒素，从而降低食品中真菌毒素的暴露风险，保证食品安全。本文根据QuEChERS 技术的特点，探讨了应用QuEChERS技术对真菌毒素进行预处理过程中，提取、盐析和净化步骤所应用的方法及对真菌毒素提取效率的影响，总结了QuEChERS技术在食品真菌毒素检测中的应用，并提出该技术现阶段应用中亟待解决的问题，提出了展望和建议，旨在推动QuEChERS技术在真菌毒素领域的深入应用。
真菌毒素是丝状真菌在新陈代谢过程中产生的化学结构各异且对人和动物有害的生物活性物质。自然界中的真菌毒素多以固体形式存在，大多数真菌毒素化学性质稳定、不易分解、易溶于有机试剂且熔点高[1]。常见的真菌毒素包括黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、伏马菌素（fumonisins，FUN）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和展青霉素（patulin，PAT）等。AFs主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、特异曲霉（Aspergillus specific）和假溜曲霉（Aspergillus tamarii）产生的代谢产物，主要污染粮油食品、玉米、花生、坚果类、乳及乳制品。其中以花生和玉米污染最严重的。它们能够抑制脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的合成，破坏凝血机制，具有高致癌和高毒性。其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的毒性最大，早在1993年就被国际癌症研究所（International Agency for Research on Cancer，IARC）列为人类一级致癌物。OTA是由赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、疣孢青霉（Penicillium verruculosum）、纯绿青霉（Penicillium verrucosum）及另外几种霉菌产生的，是异香豆素的衍生物，能够危害人畜的泌尿系统，产生急性或慢性中毒，这类毒素主要污染玉米、花生、大米和小麦等谷物。ZEN是一类2,4-二羟基苯甲酸内酯化合物，具有类雌激素的作用，能与子宫内雌激素受体发生不可逆结合，导致生殖系统机能异常，主要存在于玉米、小麦、大麦和小米等谷物。FUN是由轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioide）与串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）在适宜条件下产生的一类热稳定性较高的代谢产物，具有较强的肝脏和肾脏毒性[17]，主要污染玉米及其制品。DON是由镰孢菌（Fusarium）在低温条件下产生的，能够使人产生头痛、头晕、呕吐和中枢神经系统紊乱等症状，主要存在玉米、小麦等粮食制品中[18]。PAT是由青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）和丝衣霉属（Byssochlamys）菌产生的一种有毒内酯[19]。它是一种神经毒物，具有致畸性和致癌性，主要存在于腐烂的苹果和苹果汁中。
QuEChERS前处理方法是由美国农业部于2003年提出的一种新型的样品前处理方法，该方法最早应用于水果蔬菜中农药残留的分析[20-21]。因该方法具有快速、简单、廉价、有效、可靠和安全的特点，所以在真菌毒素分析方面也得到普遍应用，现已成功地推广和应用在多种真菌毒素的分析。QuEChERS方法一般包括3个步骤[22]：提取、盐析和净化。样品（干燥的样品，如谷物需要加水）先用乙腈、乙酸乙酯或者丙酮等有机溶剂提取，然后加入硫酸镁和氯化钠等试剂促进有机相和水相的分离，最后取部分提取液加入净化剂（佛罗里硅土、乙二胺-N-丙基硅烷、石墨化炭黑和C18键合硅胶等）经过振荡离心后，取上清液进行检测。
与传统的真菌毒素提取净化方法相比，QuEChERS方法具有如下优势：①仪器设备简单，只需要离心机、振荡器即可；②技术难度低、前处理步骤简单；③耗时短。整个提取过程不超过30 min；④通过设计提取液比例、盐包成分和净化剂的种类，可实现真菌毒素的同时提取。基于以上优点，QuEChERS技术正逐渐成为真菌毒素检测前处理领域研究的热点。
2.2.1 提取
提取作为QuEChERS技术的关键步骤之一，其效果决定了分析结果的准确性。在传统方法中，乙腈、甲醇和丙酮均具有较好的提取效果，在QuEChERS法中，乙腈因其提取效率较高，且与色谱分析（LC-MS-MS或者GC-MS）的兼容性强，应用最多。但是对于极性敏感的化合物，还需要在提取液中加入乙酸、甲酸等物质以提高其萃取效果。如OTA和FUN，可以在提取液中加入一定比例的甲酸或乙酸[23-24]以提高其提取率。
甲醇的极性低于乙腈，对于部分极性化合物具有较好的提取效率。ZHANG J M等[25]研究发现，甲醇对谷物中的FB1、FB2和OTA的提取效率高于乙腈。但对于极性较强的真菌毒素如雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol，NIV）和DON，甲醇的提取率低于60%[26]。为了取得更好的提取效果，甲醇通常不单独使用，而是与其他试剂混合使用。SOSPEDRA I等[26]以甲醇和乙腈体积比为85∶15的混合液作为提取液，应用于小麦粉中的NIV和DON的提取，回收率在86%～108%。
丙酮的极性与乙腈相似，与乙腈相比，挥发性更强，能够缩短样品浓缩的时间，对于AFs和OTA均有较好的提取效率[27]。但丙酮与水不易分层，盐析效果差，提取杂质较多，基质效应强。MOL H G J等[28]比较了三种提取溶剂甲醇、乙腈、丙酮，对真菌毒素提取的影响，结果表明丙酮提取的回收率最高，其次是乙腈。而对于基质干扰，乙腈影响最小，甲醇最差。综合考虑最终选择乙腈为提取剂，回收率范围为70%～120%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为5%～10%，且基质效应较低，能够用于日常检测。
2.2.2 盐析
提取液中的残留的水分会影响净化剂的除杂能力，通过加入一些盐可以降低有机相在水中的溶解度促进相分层和待测物向有机相中转移。常用的盐析剂有硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和醋酸钠等。其中最常用的是硫酸镁和氯化钠。硫酸镁有强结合水的能力，能够显著降低混合提取液中水的含量，氯化钠能够降低有机相的溶解度，可加速有机相和水相的分层。但是，硫酸镁吸水会放出大量热，添加过量的硫酸镁，会迅速吸收样品中的水分，容易造成样品结块从而导致提取溶剂与样品接触不完全，可能会导致提取率偏低。因此合理的盐析剂使用量，能够有效促进待测物的提取效率。在真菌毒素分析中，最常用的硫酸镁和氯化钠的质量比为4∶1，但也有其他的盐析体系应用于真菌毒素的检测[29-32]。史娜等[33]则采用硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和二水结晶盐、以及柠檬酸氢二钠合一个半水结晶盐为盐析剂对豆制品中的14种真菌毒素进行检测，该方法的回收率在65.3%～120.8%之间。
2.2.3 净化
样品经过盐析之后，蛋白质、脂肪、有机酸、色素和糖等组分并不能全部从样品中去除，这些物质会严重干扰分析结果。因此，一般采用石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）、碳18（carbon 18，C18）和乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondaryamine，PSA）等去除这些物质。GCB具有吸附平面结构的作用，可以脱除某些色素。同时它也能脱除具有平面结构的毒素，如AFs和ZEN等[34]，一般不建议用于这类毒素的检测。C18（或十八烷基硅烷键合硅胶（ostade-cylsilane，ODS））作为使用广泛的反相吸附材料，可利用非极性吸附非极性的性质，去除一些非极性的化合物，如淀粉、脂肪和糖等。苏碧玲等[35]在分析粮食制品中的DON及其代谢衍生物和ZEN时，就采用了C18和弗罗里硅土作为净化剂。PSA在结构上有两个氨基，可以通过氢键结合去除碳水化合物、有机酸和少量色素。TREBSTEIN A等[32]在分析小麦和玉米中的DON、ZEN、T-2毒素、HT-2毒素时，发现PSA能够有效地去除色素和酸性杂质，但是它也能够与FUN和OTA分子上的羧基发生反应，如果PSA使用过量会导致这类毒素回收率偏低。王少敏等[36]利用QuEChERS前处理技术研究瓜蒌皮中22种真菌毒素时，考察了C18和PSA这两种净化剂的使用量对目标化合物回收率的影响，结果发现C18量过少或者过多，会导致HT-2和赭曲霉毒素的回收率低于60%；而过多的PSA会造成FUN的回收率下降，当两者含量均为300 mg时，22种真菌毒素的回收率在80%～120%之间，相对标准偏差0.31%～7.43%。
真菌毒素主要存在于谷物及其制品、坚果和水果等食品。对于含水量较低的且含有高淀粉和高蛋白（如玉米、小麦及其制品）的样品，在提取和净化过程中基质中的淀粉和蛋白质容易发生交联性形成网状结构，使样品与毒素紧密结合，不易从样品中游离出来。因此，在样品处理时必须加入一定量的水，充分浸润样品，提高萃取效率[23-24]。CUNHASC等[37]对QuEChERS方法进行改进，并结合GC-MS快速分析了谷物中5种单端孢霉烯族毒素。由于样品含有油、脂肪和色素，在提取时采用对这些物质亲和性较弱的乙腈，考察了加水量对提取的影响，结果发现加入25 mL水能够满足回收率的要求。提取后先加入MgSO4和NaCl进行盐析，再加入C18进行净化，最后样品经过衍生后进行GC-MS分析。该方法回收率在67%～101%，RSD范围9%～21%，检出限2～15 μg/kg。张海霞等[38]建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法快速检测玉米中7种真菌毒素ZEN、DON、OTA和黄曲霉（AFs）四项的检测方法，样品经过酸化乙腈水溶液提取，加入4gMgSO4和1gNaCl进行盐析、120mgC18，200 mg PSA和600 mg MgSO4净化，氮吹近干，甲醇定容后待测。该方法的检出限为0.06～10.0 μg/kg，回收率为89.7%～112.9%，相对标准偏差＜8.7%，准确度和精密度均能够达到真菌毒素检测要求。
动物源性食品（例如肉、奶和蛋）也容易受到真菌毒素的污染，主要是因为动物食用了被真菌毒素污染的饲料和食品而残留在肉、组织或者血液中。由于动物组织脂肪和蛋白质含量较高，需要根据不同的基质选择提取溶剂和净化剂。郭礼强等[39]利用QuEChERS方法结合液相色谱-串联质谱法测定干腌火腿中15种真菌毒素，以1%甲酸-乙腈水溶液为提取液，无盐析过程，直接用ODS净化，该方法的定量下限为0.05～2.50 μg/kg，回收率为79.1%～95.5%，相对标准偏差（RSD）为3.2%～12.8%。KARASEVA N M等[40]采用QuEChERS方法对乳及乳制品样品中的AFB1和AFM1进行提取和净化，结合液液微萃取技术进行浓缩，最后经HPLC-火焰离子检测器（flame ionization detector，FLD）检测。该方法的AFB1和AFM1的检出限分别为0.1 μg/kg和0.01 μg/kg，相对标准偏差低于6%。整个分析时间1.0～1.5 h，相对于免疫亲和柱法，QuEChERS方法更加省时和节省成本。FRENICH A G等[41]利用QuEChERS前处理方法，建立了鸡蛋中10种黄曲霉毒素的高效液相色谱-串联质谱法，以1%乙酸甲醇水溶液为提取液进行提取，硫酸钠和醋酸钠为盐析剂，无进一步的净化过程，采用基质空白曲线进行校正，得到该方法的检出限为1.0～5.0 μg/kg，回收率为70%～110%，相对标准偏差低于25%。该方法简单、可靠、成本低，能够满足日常的检测。
综上所述，QuEChERS技术在多真菌毒素分析检测中体现出的优势，使得该技术备受关注。但是由于样品基质差异大，再加上有机干扰物的影响，使得部分真菌毒素的回收较低。为了降低基质干扰、提高回收率，需要对提取溶剂、盐析剂和净化剂进行正交试验或者响应面设计试验优化，这需要进行大量的实验完成。目前对于这一方面的研究甚少。周健等[42]针对鸡蛋中一种杂曲霉毒素利用响应面法优化QuEChERS法，该方法回收率在86.8%～90.4%之间，日间重复性RSD为1.5%～6.2%。
QuEChER方法不仅能够满足真菌毒素日常检测分析的需求，还简化了前处理过程，提高了样品检测效率，为多种真菌毒素的检测提供了一个极具发展潜力的方向。建立科学、准确、稳定的可同时检测食品中多种真菌毒素的预处理方法，是当前食品真菌毒素分析检测领域急需解决的问题。由于QuEChER方法最早是针对果蔬中的农药残留所设计的，其他类型的样品与果蔬基质具有一定的差异性，待测物的结构与理化性质也不同，不具有普遍适用性，需要进一步的改进，以满足多种真菌毒素的检测。
首先，提取溶剂的选择。单一溶剂提取效率不高，不能一次性把所有毒素都提取出来，导致某个或者某些毒素的回收率仅为60%左右。研究人员可以通过设计不同比例的提取溶液进行优化，选择合适的提取方式（涡旋、振荡、超声等）来实现多种毒素的提取；其次，针对样品的基质选择盐析剂的种类，并对盐析剂的添加量进行优化；最后，根据吸附剂对各种毒素的吸附能力，可以选择多种净化剂联合使用，并通过正交试验或者响应面设计优化各自的添加量，降低对目标化合物的吸附，同时减小基质效应。总之，QuEChERS方法还需要在提取溶剂、盐析剂和净化剂方面进一步改进，以满足真菌毒素的检测分析，并推动其在真菌毒素领域的发展。
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Research progress on QuEChERS technology in the detection of mycotoxins in food