头痛粉作为民间常见的解热止痛药，其功效为解热镇痛。市售的头痛粉主要由阿司匹林、对乙酰氨基酚、咖啡因3种成分组成，阿司匹林、对乙酰氨基酚主要通过抑制下丘脑的体温调节中枢前列腺素合成酶而发挥作用，主要用于治疗感冒发热、关节痛、神经痛、偏头痛、癌性痛及手术后止痛[1-4]。咖啡因作为一类中枢兴奋药，主要药效为收缩脑血管，减轻其搏动的幅度，同解热镇痛药配伍，可以增强镇痛的效果。然而近年来为减轻消费者因饮酒而由其中的杂醇油、胺类等物质引起的头痛症状[5-7]，一些不法商贩违规在白酒中添加头痛粉，以次酒冒充好酒，以达到喝了不上头的效果，欺骗消费者，谋取高额利润，同时此类药物与酒一起饮用，会对人的肝肾造成较大损伤[8-9]。
目前，针对头痛粉出现在白酒中的不良现象报道较多，国内外关于对其中成分检测文献方法几乎集中在药品制剂上[10-19]，如谢华等[10]采用高效液相色谱法（high performance liquidchromatography，HPLC）测定复方氨酚烷胺片中的对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏；王军等[11]采用超快速液相色谱（ultra-fast liquid chromatography，UFLC）仪同时测定复方氨酚烷胺片中对乙酰氨基酚和咖啡因的含量；罗少伟[14]建立了高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因含量。但作为非法添加物出现在白酒中的检测方法尚未见报道，由于白酒成分复杂，不同于一般的药物制剂，目前文献报道的这些相关方法无法满足检测的需求，这给食品监管工作带来一定的难度，因此制定快速准确的检测方法已迫在眉睫。本实验通过优化条件，建立了高效液相色谱法检测白酒中非法添加物“头痛粉”含量，该法具有简单、快捷、重复性好、回收率高等特点，以期填补白酒中非法添加检测方法的空白，为市场监管部门执法提供有力的技术支撑，从而达到保障人民的饮食用药安全的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
阿司匹林标准对照品、对乙酰氨基酚标准对照品、咖啡因标准对照品（纯度≥98%）：国药集团化学试剂有限公司；10个不同厂家白酒：市售。
1.2 仪器与设备
LC-20A高效液相色谱仪（配备二极管阵列检测器（diode array detector，DAD））：日本岛津公司；Milli-Q Reference 超纯水仪：美国Millipore公司；SG-1501系列电热板：上海硕光电子科技有限公司；Dor Yang JA-M系列电子分析天平：德国Sartorius公司；0.22 μm有机滤膜：上海钦森实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 定性分析中色谱条件优化
分别准确称取50.0 mg阿司匹林、50.0 mg对乙酰氨基酚、37.5 mg咖啡因标准对照品（精确至0.01 g）于100 mL容量瓶中，流动相溶解并定容至刻度，配制成3种标准储备溶液，质量浓度分别为0.5 mg/mL、0.5 mg/mL、0.375 mg/mL。
选择Shim-paekCLC-ODS色谱柱（150mm×6mm，5μm），将预先配制好的3种组分混合标准溶液进样，进样量20 μL，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，检测波长275 nm，分别按流动相甲醇∶水（30∶70，V/V），甲醇∶水∶冰醋酸（34∶65∶1，V/V），甲醇∶水∶冰醋酸（30∶65∶5，V/V），在其他条件相同情况下进行3次实验。
1.3.2 前处理方法的优化
直接将未经任何处理白酒样品，按1.3.1优化的色谱条件进样，与预先将酒样先100 ℃加热30 min，冷却后，加样到碱性硅藻土固相萃取柱净化处理后按相同色谱条件进样结果进行比较。
1.3.3 定量分析方法
（1）检出限与定量限：采取空白样品加标实验方法进行测定。取未检出头痛粉的白酒样品3份，分别加入适量标准对照品溶液，采用3倍信噪比（S/N）作为检出限最低响应值，计算出对乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因的检出限；10倍信噪比（S/N）作为定量限最低响应值，计算“头痛粉”中3个组分的定量限。
（2）线性关系考察：分别称取50.0 mg阿司匹林、50.0 mg对乙酰氨基酚、37.5 mg咖啡因标准对照品（精确至0.01 g）于100 mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，进一步稀释配制一系列标准工作溶液。
（3）仪器精密度实验：分别准确吸取质量浓度为5.0μg/mL、50.0 μg/mL、200.0 μg/mL的对乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因标准对照品溶液作为低、中、高质量浓度溶液，分别重复进样6次，计算三者的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
（4）加标回收及方法精密度实验：采用样品加标回收实验进行测定。取阴性白酒样品18份，分别加入适量对照品溶液，使3种组分加标的浓度分别达到定量限、2倍定量限以及10倍定量限3个添加水平，采用上述检测条件进行测定，计算“头痛粉”中3个组分加标回收率。
1.3.4 样品含量测定
（1）样品的处理[20]：准确量取酒样10 mL，100 ℃加热30 min，冷却至室温，将样品加载到碱性硅藻土固相萃取柱上，在真空条件下，样品溶液将缓慢渗入固相萃取小柱中，静置平衡10 min。经20 mL正己烷淋洗后，再用20 mL 10%乙酸乙酯-乙醚溶液（10∶90，V/V）（约1 mL/min流速）进行洗脱，洗脱液经约5 g无水硫酸钠（经400 ℃灼烧）脱水后，收集于50 mL比色管中，40 ℃条件下氮气缓慢吹至近干，再用流动相定容至10.0 mL，制成测定液，供上机分析用。
（2）根据实验建立的方法，对待测酒样非法添加物进行定性定量分析。
2 结果与分析
2.1 定性分析中色谱条件的优化
通过对甲醇∶水（30∶70，V/V）、甲醇∶水∶冰醋酸（34∶65∶1，V/V）、甲醇∶水∶冰醋酸（30∶65∶5，V/V）3组流动相色谱条件比较，发现采用甲醇∶水∶冰醋酸（30∶65∶5，V/V）作为流动相峰形较好，分离效果佳，因此选择其作为建立检测方法的流动相。
2.2 前处理方法的优化
图1 白酒经优化前处理方法处理前（A）、后（B）的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of Baijiu before (A) and after (B)treatment by optimized pretreatment method
白酒样品中含有大量乙醇成分，直接进样容易造成溶剂效应，因此本实验通过加热先挥发掉乙醇，再用超纯水定容至原体积。通过碱性硅藻土固相萃取柱净化，去除酒中酯类、酸类等成分，以减少对目标物的干扰。白酒优化处理前、后的HPLC图见图1。从图1可以看出，酒样直接进样后得到的色谱图，非目标峰比较多，且峰面积较大，尤其是在靠近目标峰时存在较大的峰，保留时间稍有偏移，就会造成目标峰识别错误，从而引起假阳性结果。也会造成目标物含量变化，定量结果出现较大偏差。
酒样经前处理后，非目标峰的数量大大减少，目标峰前后的干扰峰几乎消失，从而提高了对目标峰识别的正确率，保证了实验结果定量的稳定性与准确性。
2.3 定量方法学考察
2.3.1 检出限与定量限测定
分别进样一定浓度的3个组分标准溶液，观察噪音强度，采用3倍信噪比（S/N）作为检出限最低响应值，稀释3个组分标准溶液使得其响应强度至3倍噪音值，计算得到对乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因检出限分别为1.0 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL；稀释3个组分标准溶液使得其响应强度至10倍噪音值，以10倍信噪比（S/N）作为三者的定量限最低响应值，计算定量限分别为3.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.5 μg/mL，说明本研究所建立的实验方法灵敏度高。
2.3.2 标准谱图及线性关系
由图2可知，3种组分标准品色谱峰型良好，分离效果佳。
图2 对乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因标准品HPLC谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of paracetamol,aspirin and caffeine standards
图3 对乙酰氨基酚对照品标准曲线
Fig.3 Standard curve of paracetamol
图4 阿司匹林对照品标准曲线
Fig.4 Standard curve of aspirin
图5 咖啡因对照品标准曲线
Fig.5 Standard curve of caffeine
由图3～图5可知，在0～200 μg/mL范围内，3种对照品线性关系良好，相关系数R均＞0.999。
2.3.3 仪器精密度实验
表1 对乙酰氨基酚标准品的精密度实验结果
Table 1 Precision tests result of paracetamol standard
表2 阿司匹林标准品的精密度实验结果
Table 2 Precision tests result of aspirin standard
表3 咖啡因标准品的精密度实验结果
Table 3 Precision tests result of caffeine standard
由表1～表3可知，3种标准品的精密度实验结果RSD均＜3.2%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 加标回收率实验结果
表4 对乙酰氨基酚在不同浓度条件下的加标回收率
Table 4 Standard recovery rate of paracetamol at different concentrations
表5 阿司匹林在不同浓度条件下的加标回收率
Table 5 Standard recovery rate of aspirin at different concentrations
表6 咖啡因在不同浓度条件下的加标回收率
Table 6 Standard recovery rate of caffeine at different concentrations
由表4～表6可知，不同加标浓度水平下平均回收率为91.7%～100.6%，回收率实验结果RSD均＜4.6%。
2.3.5 样品测定结果
采用本研究建立的检测方法对市售的10种白酒进行检测，只有其中一种检出“头痛粉”，经定性分析，确认其中含有的3种成分为乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因，经定量分析，测得乙酰氨基酚、阿司匹林、咖啡因的含量分别为98.8 μg/mL、197.2 μg/mL、30.1 μg/mL，其他9种白酒均未检出非法添加的“头痛粉”。
3 结论
本研究所涉及到的白酒中非法添加物“头痛粉”是食品安全监管部门在日常执法监督时的意外发现。按照上述建立的检测方法对白酒中非法添加物“头痛粉”进行检测，方法学考察验证表明，该方法方便、快捷、准确，可对白酒中非法添加的阿司匹林、乙酰氨基酚、咖啡因进行定性及定量检测。“头痛粉”在白酒中的发现，说明在监管上存在一定程度的漏洞，让一些不法商家有机可乘。通过建立白酒中非法添加物“头痛粉”的检测方法，一方面填补了白酒中非法添加检测方法的空白，另一方面进一步扩大了监督范围，从而更有效地规范市场，使食品行业能够更加健康有序的发展。
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