麻城老米酒已有一千年酿造历史，主要产于麻城市东部地区的木子店、东古城等地。其由糯米和特制酒曲制成，色泽清亮，味道淳甜，含有丰富的营养物质和功能成分[1]。因而深受人民群众欢迎。麻城老米酒属于黄酒的一种，与黄酒相同的也含有酚类物质。
多酚又称单宁，是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。多酚的独特结构使其具有一些独特的功能性[2-3]，如清除自由基和抗衰老，多酚物质对保护心脑血管系统和预防心脏病也非常重要，它还是一种天然的肿瘤抑制剂因子，对肝癌、皮肤癌、鼻咽癌等有较强的抑制作用[4-5]。建立准确的定量方法对研究麻城老米酒的保健功能具有重要意义。国内外多酚的检测方法主要包括紫外分光光度法、荧光检测、毛细管电泳-电化学方法、高效液相色谱法，其中单体酚类的检测最常用方法是高效液相色谱（high performance liquid chormatography，HPLC）法，该方法准确、灵敏[6-8]。如姜莉等[9-10]对黑米酒、陈磊等[11]对黄酒、谭悦等[12]对木瓜酒多种酚类物质进行测定，建立了可靠的分析方法。
本实验以糯米为原料，经半固态发酵酿造获得富含多种活性成分的麻城老米酒，采用高效液相色谱法着重分析麻城老米酒中的多酚含量，旨在了解麻城老米酒中功能性成分的含量，为麻城老米酒工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
麻城老米酒：麻城市某酒厂生产的三种不同类型的酒，分别为c1（在米曲中添加酵母K）、c2（在米曲中添加酵母cxds）、c3（在米曲中添加酵母S）。
11种酚类标准品（香草酸、没食子酸、原儿茶酸、对香豆酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素、芦丁、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸）：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、甲酸、乙醇（均为色谱纯）：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；乙酸乙酯、甲酸、氢氧化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Ultimate 3000高效液相色谱仪及检测器、Hypersil Gold C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美国Thermo Scientific公司；Ev201旋转蒸发仪：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；DTD-3R超声波清洗仪：湖北鼎泰精锐仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 麻城老米酒酿造工艺及操作要点
糯米→选料→浸泡→滤水→水洗→蒸饭→摊凉→拌曲、加水→装缸→发酵→压榨→澄清→灭菌→成品
选料：选取颗粒饱满，无杂质，无霉变的糯米。
浸泡：秋季浸米的时长8～10 h，浸米水温20～25 ℃；冬季浸米的时长12～15 h，浸米水温10～15 ℃。
滤水、水洗：把浸米的水滤掉之后，再用清水清洗2～3遍即可。
蒸饭：蒸米以蒸汽冒出时开始计时，出蒸汽15～20 min，蒸米要求米粒松、软、透、不粘连。
摊凉：是在洁净卫生竹制凉席上自然降温，冷却至20～30 ℃。
拌曲：先在缸内撒一层曲，然后一层米一层曲，直到把原料放完（一缸是50 kg米），最后倒入水，再撒入剩余的曲，封缸发酵（发酵中途不能开缸）。
发酵：在20 ℃左右的情况下，发酵一个月。
压榨、澄清：经30 d发酵，酒液开始澄清，说明发酵基本结束，此时可以开坛取酒，把酒装入压榨机进行压榨，让酒糟分离。压榨出来的酒通过沉淀后，装入酒瓶中。
灭菌：75 ℃灭菌15～20 min。
1.3.2 标准溶液的配制
准确称取标准品儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素、原儿茶酸、p-香豆酸、阿魏酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸以及没食子酸于25 mL容量瓶中，甲醇定容，分别配制成儿茶素13 μg/mL、表儿茶素13.75 μg/mL、芦丁15.75 μg/mL、槲皮素16.75 μg/mL的中性酚标准品储备液，咖啡酸14 μg/mL、原儿茶酸19.5μg/mL、绿原酸16.25μg/mL、阿魏酸14.75 μg/mL、没食子酸13.75 μg/mL、对香豆酸14.25 μg/mL的酸性酚标准品储备液和香草酸16.6 μg/mL的标准储备液，储存于4 ℃冰箱中备用。将以上的各标准品储备液用甲醇稀释5倍、10倍、25倍、62.5倍、100倍，并分别进样分析作标准曲线。
1.3.3 样品前处理方法
参照文献[13-14]，取50 mL的样品，先用盐酸溶液调至pH2.0，再用150 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液并真空浓缩至干，然后用甲醇定容至5 mL，得到麻城老米酒的酸性酚。将萃取余液用NaOH溶液调至pH7.0，然后用乙酸乙酯萃取，合并萃取液并真空浓缩至干，得到麻城老米酒中性酚样品。
1.3.4 色谱条件
色谱柱为Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.1%甲酸，流动相B是甲醇，并使用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。流速1 mL/min，紫外检测波长280 nm，进样量20 μL。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution procedure
2 结果与分析
2.1 流动相的选择
图1 中性酚混合标样色谱图
Fig.1 Chromatogram of neutral phenol mixed standard
图2 稀释过的中性酚混合标样色谱图
Fig.2 Chromatogram of diluted neutral phenol mixed standard
由图1和图2可知，以C18柱用作固定相时，常用的流动相有甲醇-水、乙腈-水等。但是本实验主要检测的是酚类物质，酚类物质由于含有酚羟基、羧基，这些基团在水溶液中易发生电离，易出现拖尾现象。添加少量酸性试剂，可以抑制酚类物质的电离，提高分离度，避免色谱峰的拖尾[15-17]。分别尝试0.1%乙酸和甲醇、0.1%甲酸和甲醇、0.1%乙酸和乙腈、0.1%甲酸和乙腈，实验最终选择0.1%甲酸为流动相A，甲醇为流动相B，在此条件下，梯度洗脱时，基线发生较小的飘移，并且获得更好的分离[18-20]。为了使峰型更好，用流动相1∶1稀释样品，结果表明，稀释过后得出的峰分离效果更佳。
2.2 色谱条件的确定
从上述实验中，最终确定分离多酚类物质的色谱条件是检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL，0.1%甲酸水溶液与甲醇梯度洗脱。在该色谱条件下进样，得到标样中酸性酚及香草酸的分离色谱图和保留时间（retention time，RT）分别见图3、图4。
图3 酸性酚混合标样色谱图
Fig.3 Chromatogram of acid phenol mixed standard
图4 香草酸标样色谱图
Fig.4 Chromatogram of vanillic acid standard
由图3～图4可知，11种酚类物质得到了很好地分离。与姜莉等[5]对黑米酒、谭悦等[11]对木瓜酒、谢广发[14]对黄酒多种酚类物质进行测定相比，分离时间较短，在22 min之内，11种物质就能得到分离，且洗脱程序不复杂，分离效果良好。
2.3 标准曲线、检出限
采用以上确定的色谱条件，得到以下11种酚类物质的回归方程见表2。由表2可知，线性关系良好，且相关系数R均＞0.999 0。各组分目标物的检出限为0.117～0.156 mg/L，满足不同种类物质的检测要求。
表2 11种酚类物质回归方程及检出限
Table 2 Regression equations and detection limits of 11 phenolic compounds
2.4 老米酒中酚类物质分析
按照1.3.4方法对老米酒样品c1、c2、c3处理，对处理过的样品进行高效液相色谱分析，样品中酚类物质含量见表3。
表3 样品中酚类物质含量的测定结果
Table 3 Determination results of phenolic content in samples mg/L
注：“-”表示未检出。
由表3可知，3种不同类型的老米酒中含有丰富的酚类，其中c1老米酒中含量最高的是香草酸，其次是儿茶素、表儿茶素以及芦丁；c2老米酒中含量最高的是表儿茶素，其次是芦丁、儿茶素以及阿魏酸；c3老米酒中含量最高的是儿茶素，其次是原儿茶酸、表儿茶素以及香草酸。从测定的这11种单酚来看，儿茶素、表儿茶素、芦丁是这3种老米酒中主要的单酚物质，占总含量的比例较大。回收率测定结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.48%～2.75%，而3种不同类型老米酒11种酚类总量与绍兴黄酒比起来，含量相对较低，与红米酒比起来，含量稍高一些。这可能由于酒中的酚类物质主要来源于原料（大米、小麦）和微生物（米曲霉、酵母）的转化，特别是由于发酵周期长（传统工艺酒达100 d左右），小麦带皮发酵，麦皮中的大量酚类物质融入酒中[20-22]。老米酒发酵时长比起绍兴黄酒较短，而比起米酒时长较长，且绍兴黄酒一般用的酒曲是麦曲，而老米酒用的甜酒曲，这些原因都会导致酚类物质的含量不同。
3 结论
在选定的色谱条件下，首次采用高效液相色谱测定麻城老米酒中的11种酚类物质，并且在22 min之内使这11种物质得到了较好的分离，11种酚类物质的回收率在86.2%～102.3%，其相对标准偏差为0.48%～2.75%，说明此测定方法准确可靠。
由以上实验可知，麻城老米酒中含有一定量的酚类物质。3种不同类型的老米酒中含有丰富的酚类，其中c1老米酒中含量最高的是香草酸，其次是表儿茶素、儿茶素以及芦丁，c2老米酒中含量最高的是表儿茶素，其次是儿茶素、芦丁以及阿魏酸，c3老米酒中含量最高的是儿茶素，其次是表儿茶素、原儿茶素以及芦丁。从测定的这11种单酚来看，儿茶素、表儿茶素、芦丁是这3种老米酒中主要的单酚物质，占总含量的比例较大。并使其测定结果与绍兴黄酒、红米酒中酚类物质含量的对比发现，麻城老米酒中酚类物质的含量与其工艺密切相关，为老米酒类产品的开发和保健功能的研究提供依据。
本次实验只对麻城老米酒中的酚类进行了检测，而麻城老米酒中不仅仅含有酚类，还含有其他的功能成分，比如氨基酸、维生素等，有待进一步的研究。
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