白背三七（Gynura divaricata L.）为菊科菊三七属多年生草本植物，又名白子菜、明月草、大肥牛等，原产于广西、福建一带潮湿的阴地上[1]。白背三七茎叶中含有丰富的粗蛋白、粗纤维、矿物质、维生素等营养素，我国南方民间常以白背三七为上等野菜食用；同时《中药大辞典》记载，白背三七味辛、淡，性平，具有清热凉血、活血止痛、止血等功效，对高血压、糖尿病、高血脂等症状能起到良好的改善作用。由于同时具有良好的食、药兼用特性，且扦插繁殖系数高、生长迅速，近年来长江中下游地区陆续出现白背三七大面积的种苗生产和栽培。研究表明，白背三七含有大量的活性多糖、类黄酮、萜类、生物碱等天然有效成分[2-4]，可全草入药。目前，关于白背三七的研究大多集中于活性多糖提取和功能性上[5-8]，而针对该植物另外一种主要活性成分类黄酮的研究较少[9-10]。
类黄酮化合物是植物在生长过程中产生的一类次生代谢产物，主要贮藏在叶片之中，是药用植物的主要活性成分之一。现在医学研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抑制癌细胞增殖，消除炎症、降低血糖、血脂等生理活性[11-14]，是制备功能性食品和开发高效低毒天然药物的重要原材料。类黄酮化合物一般难溶水，易溶于石油醚、正丁醇、乙酸乙酯等有机溶剂；因分子中多有酚羟基而呈酸性，故可溶于稀碱液，常见的提取方法有有机溶剂萃取法、醇提取法、碱法及超临界流体（CO2）萃取法[15-16]。有机溶剂萃取虽然操作方便，提取率高，但产品中容易混入较多杂质，分离困难；碱法提取杂质较少，提取物纯度高，但提取率较低；超临界流体萃取需要在高压的环境下进行，对设备的要求高，提取成本大；醇提取法设备要求简单，产物杂质少，提取率高等优点，缺点是甲醇具有挥发性和毒性[17]。因此，本研究采用无毒性的乙醇水溶液作为溶剂，对白背三七类黄酮化合物进行提取，并采用单因素及正交试验优化提取工艺条件，旨在为白背三七深加工提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白背三七鲜叶：采自江苏农牧科技职业学院园林园艺学院校内实训基地（2017年8月）；芦丁标准品（纯度≥98%）：上海伊卡生物技术有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、过硫酸钾（均为分析纯）：中国医药集团上海化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
AL204-型分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；THZ-82A水浴恒温振荡器：江苏荣华仪器制造有限公司；6L-冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；SP-2100UV紫外分光光度计：上海光谱仪器有限公司；ELTA-320精密pH计：梅特勒-托利多中国有限公司；TGL-16MB高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；TF101-2电热鼓风干燥箱：苏州同福烘箱制造有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 白背三七类黄酮提取工艺
白背三七鲜叶低温烘干（45 ℃、12 h）后，粉碎过60目筛。准确称取一定量样品粉末于锥形瓶中，按不同料液比加入乙醇溶液，水浴振荡提取一定时间后过滤，将滤液真空浓缩至黏稠态，冷冻干燥后即得白背三七类黄酮提取物冻干粉，置冰箱冷藏备用[18]。
1.3.2 提取工艺条件优化
（1）单因素试验：单因素试验主要考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、乙醇体积分数（45%、55%、65%、75%、85%、95%）、提取温度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）和提取时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min）对白背三七类黄酮得率的影响。
（2）正交试验：在单因素试验的基础上，确定不同因素的水平范围，以类黄酮得率为考察指标，进行4因素3水平L9（34）正交试验设计，优化白背三七最佳的提取工艺组合，各因素与水平见表1。
表1 提取工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization
1.3.3 白背三七类黄酮化合物的测定
类黄酮化合物的测定采用分光光度法[19]。
芦丁标准曲线的制作：配制不同质量浓度的芦丁标准液，以亚硝酸钠-硝酸铝为显色剂，采用分光光度法于波长510 nm处测定吸光度值[19]。以芦丁质量浓度（x）为横坐标、吸光度值（y）为纵坐标，绘制芦丁标准曲线；标准曲线回归方程为：y=11.436x+0.000 6，相关系数R2=0.999 5，说明芦丁在质量浓度为0～0.06mg/mL范围内，有良好的线性关系。
白背三七类黄酮化合物得率：准确称取一定质量白背三七类黄酮提取物，用体积分数为30%的乙醇溶液定容于25 mL比色管中，混合均匀，于波长510 nm处测定吸光度值，按照标准曲线回归方程计算样品中类黄酮化合物的含量。白背三七类黄酮化合物得率计算公式如下：
式中：M为白背三七叶干粉质量，g；N为类黄酮提取物的质量，g；X为提取物中类黄酮含量，%。
2 结果与分析
2.1 白背三七类黄酮提取工艺优化单因素试验
2.2.1 乙醇体积分数对类黄酮得率的影响
准确称取10 g白背三七叶干粉6份放入500 mL烧杯，按照料液比1∶20（g∶mL）分别加入不同体积分数（45%、55%、65%、75%、85%、95%）乙醇溶液，60 ℃水浴振荡提取90 min后过滤，将滤液真空浓缩至黏稠态，冷冻干燥后测定类黄酮得率。不同乙醇体积分数对白背三七类黄酮得率的影响如图1所示。
图1 乙醇体积分数对类黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids
乙醇溶液是从植物中提取类黄酮的最常用溶剂。提取过程中，乙醇体积分数对类黄酮的提取效果具有较大影响：一般认为高浓度的乙醇溶液适用于黄酮苷元的提取，低浓度乙醇溶液有利黄酮苷类物质的溶出。因此，选择合适的乙醇浓度可以提高类黄酮的得率。由图1可知，乙醇体积分数在45%～75%范围内，类黄酮得率随着乙醇体积分数的增加而增大；乙醇体积分数增加至75%时，类黄酮得率达到最大值（3.36%）；当乙醇体积分数＞75%之后，类黄酮得率明显降低，主要由于高浓度的乙醇溶液使得一些醇溶性杂质、色素及亲脂性强的成分溶出量增加，同类黄酮化合物竞争与乙醇-水分子溶液体系结合，导致类黄酮类化合物的得率不升反降。因此，白背三七类黄酮提取适宜的乙醇体积分数为75%。
2.2.2 料液比对类黄酮得率的影响
准确称取10 g白背三七叶干粉6份放入500 mL烧杯，按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL）等不同料液比分别加入体积分数75%乙醇溶液，60 ℃水浴振荡提取90 min后过滤，将滤液真空浓缩至黏稠态，冷冻干燥后测定白背三七类黄酮得率。不同料液比对白背三七类黄酮得率的影响如图2所示。
图2 不同料液比对类黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of different material-liquid ratio on the yield of flavonoids
类黄酮化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类植物次生代谢产物，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化和还原产物，即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。在植物体内大部分与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在，也有的以游离形式存在。类黄酮乙醇溶液中的溶解度与其化学组成密切相关[20]。由图2可知，料液比在1∶10～1∶20（g∶mL）范围内，类黄酮得率快速提高；当料液比达到1∶25（g∶mL），类黄酮得率达最大值（3.43%）；继续增大提取液的比例，类黄酮得率略有下降，主要原因可能为乙醇溶液例比过大时，白背三七中其他组分溶出增加，降低了类黄酮物质提取率。因此，白背三七类黄酮提取适宜的料液比为1∶25（g∶mL）。
2.2.3 提取温度对类黄酮得率的影响
准确称取10 g白背三七叶干粉6份放入500 mL烧杯，按照料液比1∶25（g∶mL）加入体积分数75%乙醇溶液，分别在45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃水浴条件下振荡提取90 min后过滤，将滤液真空浓缩至黏稠态，冷冻干燥后测定白背三七类黄酮得率。不同提取温度对白背三七类黄酮得率的影响如图3所示。
由图3可知，提取温度在45～60 ℃范围内，类黄酮得率随提取温度的增高而增大；提取温度在60 ℃时，类黄酮得率达最大值（3.27%）；当提取温度＞60 ℃之后，类黄酮得率降低，且提取液颜色变深，主要原因可能为部分类黄酮化合物发生氧化反应，分子中3位羰基、酚羟基及分子内氢键等结构遭到破坏，导致少量类黄酮损失。此外，温度过高会增加蛋白质、糖类等水溶性杂质溶出，对类黄酮苷形成“包裹”，从而减少了类黄酮的溶出[21]。因此，白背三七类黄酮适宜的提取温度为60 ℃。
图3 提取温度对类黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of extracting temperature on the yield of flavonoids
2.2.4 提取时间对类黄酮得率的影响
准确称取10 g白背三七叶干粉6份放入500 mL烧杯，按照料液比1∶25（g∶mL）加入体积分数75%乙醇溶液，60 ℃水浴条件下分别提取30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min后过滤，将滤液真空浓缩至黏稠态，冷冻干燥后测定白背三七类黄酮得率。不同提取时间对白背三七类黄酮得率的影响如图4所示。
图4 提取时间对类黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of extracting time on the yield of flavonoids
由图4可知，提取时间在30～120 min时，类黄酮得率随提取时间的延长而增大；当浸提时间为120 min时，类黄酮得率达3.36%；继续延长提取时间，类黄酮得率无明显提高，表明浸提120 min，类黄酮几乎完全溶出，但继续延长提取时间会增大能耗。因此，白背三七类黄酮适宜的提取时间为120 min。
2.3 提取工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以类黄酮得率为考察指标，采用4因素3水平L9（34）正交试验优化白背三七类黄酮提取工艺，试验结果与分析见表2。
由表2可知，在试验确定水平范围内，各因素对类黄酮得率的影响大小依次为A（乙醇体积分数）＞D（提取温度）＞B（料液比）＞C（提取时间）；类黄酮最优工艺组合为A3B2C2D2，即乙醇体积分数85%，料液比1∶25（g∶mL），提取时间120 min，提取温度60 ℃。在此优化条件下进行3次平行验证试验，类黄酮平均得率为3.81%。
表2 提取工艺条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization
在试验选定的水平范围内，提取时间对白背三七类黄酮得率的影响较小（极差最小），以其作误差项，采用SPSS16.0对正交试验结果进行方差分析，结果见表3。
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响差异显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响差异极显著（P＜0.01）。
由表3可知，试验模型F值为119.94，产生误差的可能性只有0.008，具有显著性。决定系数R=0.997，说明试验模型与实际试验结果具有高度的拟合性（P＜0.05），可以用此模型来预测和分析白背三七类黄酮提取过程中得率与影响因素之间的关系[20]。乙醇体积分数对类黄酮得率影响达到极显著水平（P＜0.01），提取温度对类黄酮得率均具有显著影响（P＜0.05），料液比对类黄酮得率影响不显著（P＞0.05）。由此可知，白背三七类黄酮提取过程中，适宜的乙醇体积分数是获得高得率类黄酮的关键因素。
3 结论
通过试验考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度对白背三七类黄酮得率的影响：料液比影响较小，乙醇体积分数和提取温度影响显著。白背三七类黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数85%，料液比1∶25（g∶mL），提取时间120 min，提取温度60 ℃。在此优化条件下，类黄酮平均得率3.81%。研究结果可为白背三七的深加工和综合开发提高参考和依据。
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