柿子（Diospyros kaki）属于柿科柿属，多年生落叶果树，与葡萄、柑橘、香蕉、苹果并称为我国五大水果。我国柿子产量和种植面积位居世界首位[1]。在品种上，主要分为完全涩柿、不完全涩柿、完全甜柿、不完全甜柿。我国的主要栽培品种是涩柿，其中磨盘柿是涩柿类的典型代表。甜柿在我国栽培量小，其品种大部分来源于日本，被称为“果中圣品”的柿子富含多糖、果胶、酚类物质、维生素及矿物质等生物活性物质[2]。我国柿子的深加工率相对较低，加工产品比较单一，主要加工产品是传统的柿饼。近年来，以柿子为原料进行深加工的研发工作日渐增多，如柿糕冻、柿汁、果脯、柿子茶等产品，但加工量不是很大，出现供需矛盾，价格连年降低，导致全国许多地方出现“丰产不丰收”的现象，不但严重浪费资源，也极大伤害了果农的积极性，不利于柿子产业发展[3-6]。因此，亟需一种柿子高值化利用技术。
研究表明，柿子酒是经过原料选择、脱涩、破碎打浆、酶解、发酵、陈酿、澄清等加工过程获得饮料酒，具有柿子独特的果香和色泽，口感醇厚、酒体饱满、香气怡人，且能较好的保留柿子的营养价值[7-9]。研究表明，柿子酒有防止心脑血管疾病、抗氧化、抗癌、抗菌、促进新陈代谢及美容养颜等生物功能[7，10-11]。柿子酒被认为是目前柿子高值化利用的最为主要的产品之一。以柿酿酒不但能够提高柿子的资源利用率，而且有利于果农增收，符合我国的产业政策[12-14]。伴随着柿子酒加工业壮大，富含柿子色素等营养及功能成分的柿子加工废弃也大量产出，不但会产生资源浪费，也会导致环境污染[15-16]。相对于合成色素，天然植物色素的安全性及需求量也逐渐增加[17-19]。微波辅助萃取法是20世纪80年代兴起的一种前处理技术，在食品有效组分提取中得到了广泛应用[20]。超声波提取技术是食品行业一种新型的提取分离技术，能够促使被提取物质快速高效溶出[21]。因此，本研究将微波、超声技术应用于柿子色素提取中，研究柿子色素最佳提取工艺，以实现柿子色素高效经济提取，为柿子深加工产业的科学化发展寻求新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
柿子酒渣（磨盘柿）：莱芜万邦食品有限公司；β-胡萝卜素（标准品）、无水乙腈、丙酮（色谱纯）：北京谱析科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HPLC-2611高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；UV-2450全波长扫描仪：日本岛津有限公司；KQ-600DB数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；KJ23C-AN2美的微波炉（设定低、中、高档，对应微波功率分别为200 W、400 W、800 W）：美的微波电器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柿子酒渣中色素提取工艺流程及操作要点
精确称取55 ℃干燥柿子酒渣10.0 g，在设定微波功率下预处理，每5 s停一次，经多次处理达到时间要求，加入100 mL提取溶剂，在设定超声功率、超声温度条件下对样品进行超声辅助提取到设定时间后对其进行抽滤，滤液即为柿子酒渣色素提取液。将提取液定容至100 mL，在最大吸收峰的波长条件下测定柿渣色素提取液吸光度值。
1.3.2 提取条件优化单因素试验
不同溶剂对柿子酒渣色素提取效果的影响：取5份10.0g柿子酒渣，分别加入100 mL乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、石油醚，室温浸提24 h，提取液定容至100 mL，在波长448 nm处测定吸光度值。
乙醇体积分数对柿子酒渣色素提取效果的影响：取5份10.0 g柿子酒渣，分别加入100 mL 体积分数为80%、85%、90%、95%、100%的乙醇，室温浸提24h，提取液定容至100mL，在波长448 nm处测定吸光度值。
微波处理功率对柿子酒渣色素提取效果的影响：取3份10.0 g柿子酒渣，设定800 W、500 W、300 W三个不同微波功率对样品进行相同时间（40 s）处理，加入100 mL体积分数为90%的乙醇，在超声功率420 W、超声时间40 min、超声温度30 ℃的条件下进行提取，研究微波处理功率对柿子酒渣色素提取效果的影响。
微波处理时间对柿子酒渣色素提取效果的影响：取5份10.0 g柿子酒渣，设定20 s、30 s、40 s、50 s、60 s（每5 s停一次）五个不同微波时间，采用确定的微波功率进行处理，加入100 mL体积分数90%的乙醇，在超声功率420 W、超声时间40 min、超声温度30 ℃的条件下进行提取，定容至100 mL，在波长448 nm处测定提取液吸光度值。
超声波处理时间对柿子酒渣色素提取效果的影响：固定其他条件不变，分别调整超声时间为20 min、40 min、60 min、80 min、100 min，研究超声时间对柿子酒渣色素提取效果的影响。
超声波功率对柿子酒渣色素提取效果的影响：取5份10.0 g柿子酒渣，加入100 mL体积分数为90%的乙醇，微波预处理后，在超声温度30 ℃，采用不同超声功率300 W、360 W、420 W、480 W、540 W，按确定的时间进行浸提处理，研究超声波功率对柿子酒渣色素提取效果的影响。
超声温度对柿子酒渣色素提取效果的影响：固定其他条件不变，分别调整超声提取温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70 ℃，研究超声温度对柿子酒渣色素提取效果的影响。
1.3.3 提取条件优化正交试验
在单因素试验的基础上，选择微波时间（A）、超声时间（B）、超声功率（C）、超声温度（D）4个因素进行L9（34）正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 柿子酒渣色素提取条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction condition optimization of pigment from persimmon wine residue
1.3.4 测定方法
提取效果分析方法：参考李晓银等[22]的方法对柿子酒渣色素提取物进行鉴定，结果表明柿子酒渣色素主要成为类胡萝卜素。因此，选用吸收波长448 nm为最佳测定波长，测定提取液吸光度值的大小来反映提取效果优劣。
采用刘新艳等[23]的方法分别测定柿子酒渣色素含量（M）及提取液色素含量（m），提取率计算公式如下：
1.3.5 数据分析
在试验过程中利用Excel 2010、SPSS 21.0、DPS 7.05进行试验设计及数据分析，并结合方差分析进行总体比较，每个试验均做3次平行，试验结果以均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 不同提取溶剂对柿渣色素提取效果影响
由图1可以看出，不同溶剂对柿子酒渣色素提取效果不同，其中以乙醇和丙酮最佳，其提取液吸光度值分别达到0.192和0.188。差异性分析表明，二者提取效果没有明显差异（P＞0.05）。从节约成本和试剂安全角度考虑，选择乙醇为提取溶剂。
图1 提取溶剂对柿渣色素提取效果影响
Fig.1 Effect of extraction solvent on pigment extraction from persimmon residue
2.1.2 乙醇体积分数对柿子残渣色素提取效果的影响
图2 乙醇体积分数对柿渣色素提取效果的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on pigment extraction from persimmon residue
由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，柿子酒渣色素提取效果逐渐变好，当乙醇体积分数达到90%时，提取液吸光度值达到0.019 8，继续提高乙醇体积分数，其提取效果变化不明显（P＞0.05），因此，选择乙醇体积分数为90%。
2.1.3 微波功率对柿子残渣色素提取效果的影响
图3 微波功率处理对柿渣色素提取效果的影响
Fig.3 Effect of microwave power on pigment extraction from persimmon residue
由图3可知，以体积分数90%的乙醇为提取溶剂，在不同微波功率下处理柿子渣，提取液的吸光度值随着微波功率的增大而减小，微波功率200 W处理柿子酒渣，提取液吸光度值达到最大（0.213）。太强的微波处理可能会导致柿子酒渣色素性质改变，不利于色素的稳定性。因此，选择微波功率为200 W。
2.1.4 微波处理时间对柿子残渣色素提取效果的影响
图4 微波处理时间对柿渣色素提取效果的影响
Fig.4 Effect of microwave processing time on pigment extraction from persimmon residue
由图4可知，随着处理时间的延长，提取液的吸光度值逐渐增大，在40 s时提取效果达到最佳，提取液吸光度值达0.219，继续增加微波处理时间，提取液的吸光度值逐渐开始下降。时间较短时柿子色素溶出量较少，提取率相对较低。在较长时间微波条件下，分子运动速度及渗透、扩散及溶解速度加快，柿子酒渣色素的溶出量大、提取率提高；但若微波处理时间过长，柿子酒渣色素容易破坏，提取率降低。因此，选择微波处理时间为40 s。
2.1.5 超声波处理时间对柿子残渣色素提取效果的影响
图5 超声波处理时间对柿渣色素提取效果的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic processing time on pigment extraction from persimmon residue
由图5可知，随着超声时间延长，柿子酒渣色素提取液的吸光值逐渐提高。超声处理80 min时，其提取液的吸光度值达到最大（0.299）。当超声时间＞80 min后，色素提取逐渐效果降低。造成超声波处理时间增长而提取效果变差的原因可能是因为超声处理时间过长使柿子色素性质改变，从而影响了柿子色素的提取。因此，选择超声提取时间为80 min。
2.1.6 超声波处理功率对柿子残渣色素提取效果的影响
图6 超声波功率对柿渣色素提取效果的影响
Fig.6 Effect of ultrasonic processing power on pigment extraction from persimmon residue
由图6可知，随着超声波功率的增加，提取液的吸光度值呈上升趋势，柿子酒渣色素的提取效果越来越好。当超声功率达到420 W时，提取液吸光度值达到最大（0.309）。420 W之后逐渐下降。可能超声波功率＜360 W之前超声处理对柿子色素影响不够，＞420 W之后对柿子色素的提取有反向作用。因此，选取超声功率为420 W。
2.1.7 超声波处理温度对柿子残渣色素提取效果影响
图7 超声波处理温度对柿渣色素提取效果的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic processing temperature on pigment extraction from persimmon residue
温度能够加速溶质传递，提高提取速率和效率。从图7可知，在试验温度范围内，随着超声温度的提高，提取效率逐渐提高。超声温度为60 ℃，提取液吸光度值达到0.392。超声温度高于60℃之后，继续升温，提取效果降低，主要原因是高温使色素被破坏。因此，选择超声波处理温度为60 ℃。
2.2 正交试验
柿子酒渣色素提取条件优化正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。
表2 柿子酒渣色素提取条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction condition optimization of pigment from persimmon wine residue
表3 正交试验方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
利用DPS软件对试验数据进行分析。根据极差的大小，可以判断试验指标的主次顺序。由表2中的极差数据分析可知，RA＞RB＞RD＞RC，微波时间对提取效果的影响最显著，其次超声时间，影响最不明显的是提取时间，最优水平组合为A2B2C2D1，即微波时间40 s，超声时间80 min，超声功率420 W，超声温度50 ℃。在此优化条件下，获得色素提取液吸光度值为0.458（提取率89.6%），较优化前吸光度值提升了0.266（是优化前的1.71倍）。由表3可知，微波时间对柿子酒渣色度提取率影响显著（P＜0.05），在实验范围内，超声时间、超声功率及超声温度对柿子酒渣色素提取率影响不显著（P＞0.05）。
3 结论
柿子酒渣色素最佳提取条件为乙醇体积分数90%、微波处理功率300 W，微波处理时长40 s，超声波处理功率420 W，超声时间80 min，超声温度50 ℃。该条件下，柿子酒渣色素提取率为89.6%，是优化前提取率（52.5%）的1.71倍。因此，微波、超声联合辅助乙醇提取法不但能够较大程度提高色素提取效率，又能够节省时间（80 min）。因此，微波、超声联合提取是柿子酒渣色素提取的一种行之有效的方法。
[1]艾呈祥.中国柿品种资源的分布现状与新技术在育种上的应用[J].落叶果树，2011，43（3）：9-11.
[2]刘瑞，于章龙，孙元琳，等.特色柿子酒酿造工艺[J].食品工业科技，2018，39（12）：114-118，131.
[3]刘滔，朱维，李春美.我国柿子加工产业的现状与对策[J].食品工业科技，2016，37（24）：369-375.
[4]江水泉，孙芳.中国柿子产业现状及工业化发展趋势[J].现代农业装备，2019，40（2）：66-70.
[5]胡婉珊，郭琳博，李宇华，等.柿子加工中关键技术的研究进展[J].食品科学，2010，31（13）：342-346.
[6]吴玉鹏，赵晓梅，阿里叶提·牙森，等.柿产业存在的问题及发展对策[J].食品科学技术学报，2011，29（4）：75-78.
[7]荆雄.柿子酒酿造条件优化及其非酿酒酵母的应用[D].西安：陕西科技大学，2019.
[8]刘晓艳，白卫东，沈颖，等.混菌发酵对柿子酒风味的影响研究[J].中国酿造，2012，31（9）：102-106.
[9]KIM D H,LEE S B,JEON J Y,et al.Development of air-blast dried non-Saccharomyces yeast starter for improving quality of Korean persimmon wine and apple cider[J].Int J Food Microbiol,2018,290:193-204.
[10]BO Z,WU J,YU Y,et al.Evolution of the antioxidant capacity and phenolic contents of persimmon during fermentation[J]. Food Sci Biot,2017,26(3):1-9.
[11]ZHU J C,NIU Y W,FENG T,et al.Evaluation of the formation of volatiles and sensory characteristics of persimmon (Diospyros kaki L.f.)fruit wines using different commercial yeast strains of Saccharomyces cerevisiae[J].Nat Prod Res,2014,28(21):1887-1893.
[12]荆雄，杨辉，苏文，等.非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵柿子酒特性的研究[J].中国酿造，2018，37（12）：52-56.
[13]陈珍金，刘绘鹏，郭伟灵，等.柿子酒液态发酵工艺条件优化研究[J].安徽农业科学，2017，45（27）：103-106.
[14]金光，周平，廖汝玉，等.不同脱涩处理对红柿果实可溶性单宁含量及ADH 和PPO 酶活性的影响[J].西南大学学报：自然科学版，2010，32（12）：32-36.
[15]施宝珠.柿皮色素成分鉴定与功能性评价[D].杨凌：西北农林科技大学，2018.
[16]张雅利，梅建生，张美月.柿色素的提取及稳定性研究[J].食品科技，2006（10）：148-152.
[17]田喜强，董艳萍，马松艳.茄子皮红色素浸提工艺及稳定性研究[J].中国酿造，2014，33（5）：133-136.
[18]肖正春，张广伦.我国植物食用色素资源开发利用评价[J].中国野生植物资源，2014，33（1）：45-54.
[19]田龙.柿子红色素的微波-超声波法协同提取及其理化性质研究[J].西北林学院学报，2007，22（6）：121-124.
[20]覃艳，乐龙，王志祥.响应曲面法优化微波提取辣椒红色素的工艺[J].中国酿造，2011，30（2）：100-103.
[21]洪松彬，何石兰，黄海潮，等.表面活性剂-超声协同提取红景天总黄酮工艺优选[J].中国药业，2019，28（4）：8-11.
[22]李晓银，岳红，丛日新，等.柿皮黄色素主要成分的鉴别及提取工艺条件的选择[J].理化检验-化学分册，2008，44（5）：455-475.
[23]刘新艳，吕军，刘中笑，等.高效液相色谱法分析蔬菜水果及其制品中类胡萝卜素含量的研究[J].农产品质量与安全，2017（2）：39-43.