北五味子（Schisandra chinensis）是木兰科植物五味子的成熟果实，具有敛肺滋肾、生津收汗等功效。作为一种新型的“药食同源”功能性保健食品，五味子富含多种营养成分和药效成分。大麦芽是由禾本科植物大麦的成熟果实经发芽干燥后炮制而成的[1]。发芽大麦含有丰富水解酶类，能使大分子淀粉和蛋白质得以分解溶出。
中国生物发酵产业协会发布的《酵素产品分类导则》标准中，将酵素定义为以动物、植物和食用菌等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的可食用的酵素产品[2]。它不仅保留了原有的营养物质，还能够改良不良的风味。不同种类的酵素还会通过发酵代谢产生特有的生物活性成分。近年来，我国对果蔬类酵素发酵工艺进行了深入研究。杨婧娟等[3]以枸杞、芦荟、山楂、薏苡仁、山药和芦荟为原料，开发新的酵素产品，获得的最优原料配方为芦荟10.00%、枸杞45.29%、薏苡仁10%、山药10%、山楂24.71%。最后得到了抗氧化活性和抑菌活性较高的复合型酵素产品；董洁等[4]利用酵母菌和乳酸菌发酵金丝小枣枣泥酵素，通过正交试验得出接种0.1%酵母菌，30 ℃条件下发酵12 h之后，再接种0.5%乳酸菌，37 ℃条件下发酵28 h，最后把温度控制在6～8 ℃条件下放置24 h，可得到感官评价较好，理化指标较为理想的金丝小枣枣泥酵素。YOON K Y等[5]使用4种乳酸菌对甜菜汁进行发酵，研究发现，植物乳杆菌和嗜热链球菌更适合作为甜菜汁的发酵菌株。大量研究表明，酵素具有抗疲劳、抗衰老、抑菌消炎、提高机体免疫力、保护肝脏、降血脂、促进消化、抗氧化抗肿瘤、控制糖病、清除自由基、抗诱变突变等功能[6-8]。赵金凤等[9]研究发现，敖东酵素可以显著增强小鼠脾淋巴细胞的再生能力，对其免疫系统有一定的调节作用。杨志鹏等[10]试验表明，海棠果酵素对清除人体内胆固醇有较好的效果，其降解率为73.4%。
本试验以新鲜的北五味子和麦芽为原料，以植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为菌种，制备北五味子麦芽酵素；并对其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）酶活性以及体外抗氧化活性进行测定，以期为北五味子麦芽酵素综合性开发提供相关依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
北五味子、大麦芽：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）：购买于中国工业微生物种保藏中心；Pectinex Ultra Color果胶酶（10 000 U/mL）：诺维信（中国）生物技术有限公司；SOD酶活力检测试剂盒、总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）：南京建成生物工程研究所；三羟甲基氨基甲烷：上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯三酚、无水碳酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢、冰乙酸、维生素C（vitamin C，VC）等（均为分析纯）：天津大茂化学试剂厂；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-1100紫外可见分光光度计：上海凌析达仪器；HR7633打浆机：飞利浦家庭电器（珠海）有限公司；WS108手持式折光仪：河北润联科技开发有限公司；TD5Z低速平衡离心机：金坛市城西春兰试验仪器厂；HWS电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；DL-CJ-1N超净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；EX324电子分析天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信试验仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 北五味子麦芽酵素制备的工艺流程及操作要点
北五味子酶解：把北五味子果用水清洗干净，果梗去除，打浆机破碎，添加1.6～2.0 mL/kg Pectinex Ultra Color果胶酶，在50 ℃条件下酶解2 h，60目绢布过滤，滤液冷却备用。
麦芽糖化：大麦芽用磨粉机磨粉，过40目筛，浸入38～40 ℃温水（料水比为1∶3）中浸泡40 min，再调整温度至52 ℃，并浸泡30 min。随后将温度控制在63～65 ℃左右，经过60 min，再次调节温度至78 ℃，保温20 min灭酶，然后用100目筛网过滤，冷却备用。
杀菌：采用超声波杀菌方式对其原料进行杀菌。将按一定比例配好的原液在超声波下处理15 min后，冷却至室温后接种。
菌种活化：将植物乳杆菌接入已经灭菌的MRS肉汤培养基中活化，放在37 ℃培养箱中，培养24 h后取用。
接种、发酵：接入活化好的植物乳杆菌，在试验设计的不同温度和时间等条件培养下，进行静置发酵，得到酵素产品。
1.3.2 单因素试验
原料配比的确定：分别调整北五味子和麦芽的比例为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（g∶g），在原料杀菌冷却之后，接种2%的植物乳杆菌，在41 ℃条件下发酵3 d，测定其SOD酶活力，以确定最适原料比例。
发酵时间、温度与接种量的确定：在北五味子∶麦芽为2∶1（g∶g）的条件下，分别调整植物乳杆菌的接种量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%），在不同温度（35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃）条件下分别发酵1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，以SOD酶活力为评价指标，确定植物乳杆菌合适的发酵时间、发酵温度与接种量。
1.3.3 正交试验
在单因素试验的基础上，以SOD酶活力作为评价指标，采用L9（33）正交设计进行正交试验，以确定其最佳的发酵工艺条件。正交试验因素水平见表1。
表1 北五味子麦芽酵素发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Schisandra chinensis and malt Jiaosu fermentation condition optimization
1.3.4 测定方法
（1）SOD酶活力的测定：将酵素液3800r/min离心10min，根据SOD酶试剂盒的要求进行酶活力测定。
（2）ABTS+自由基清除能力的测定：根据试剂盒说明书进行测定，根据其标准曲线回归方程y=-1.121 4x+1.126 2（R2=0.995 7）来计算清除能力，其中x为吸光度值，y为测试样品的抗氧化能力。
（3）羟自由基（·OH）清除能力的测定：取0.1 mL样品，加入2 mL 6 mmoL/L的H2O2溶液、FeSO4溶液，混合均匀，静置10 min之后，加入2 mL 6 mmol/L的水杨酸溶液，再次混匀，37 ℃条件下水浴1 h，调节波长为510 nm，测定吸光度值A1。以去离子水为参比溶液，测定吸光度值A0。以同体积的蒸馏水代替水杨酸溶液，测定吸光度值A2[12]。根据下式计算羟自由基清除能力。
（4）超氧阴离子自由基
清除能力的测定：采用邻苯三酚自氧化法[12]。取0.1 mL样品，加入4.5 mL在25 ℃条件下预热20 min的Tris-HCl溶液（pH为8.2），以及0.4 mL浓度为25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀，在25 ℃条件下水浴5 min，然后加入1 mL浓度为8 mol/L 的盐酸溶液，调节波长为325 nm，测定吸光度值A1。空白对照以蒸馏水代替样液，测定吸光度值A0。以同体积的蒸馏水代替邻苯三酚溶液，测定发酵液在体系中的吸光度值A2。根据下式计算超氧阴离子自由基清除能力。
（5）DPPH自由基（DPPH·）清除能力的测定：在试管中加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液以及2 mL稀释后的样品溶液，25 ℃条件下避光30 min。用无水乙醇调零，调节波长为517 nm，测定其吸光度值A1。空白对照用无水乙醇代替样液，测定吸光度值A0，以等体积的无水乙醇代替DPPH乙醇溶液，测定吸光度值A2[13]。根据下式计算DPPH自由基清除能力。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 北五味子麦芽酵素原料配比的确定
图1 不同原料配比对酵素超氧化物歧化酶活力的影响
Fig.1 Effect of different raw material ratio on superoxide dismutase activity in Jiaosu
由图1可知，北五味子∶麦芽=2∶1（g∶g）时，酵素产品中SOD酶活力最高可达3 263.21 U/mL，而后随着北五味子的含量提高，SOD酶活力开始下降。因此，选择最适的北五味子∶麦芽为2∶1（g∶g）。
2.1.2 北五味子麦芽酵素发酵时间的确定
图2 发酵时间对酵素超氧化物歧化酶活力的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on superoxide dismutase activity in Jiaosu
由图2可知，随着发酵时间的延长，发酵液中SOD酶活力呈先上升后下降的趋势。SOD酶活力在发酵第3天时达到最高值3 263.21 U/mL。第3天后SOD酶活力下降的原因可能是发酵后期菌体处于衰亡期导致营养物质被大量消耗，但又未及时补充，抑制了SOD酶的积累[14]。因此，选择植物乳杆菌发酵制备北五味子麦芽酵素的适合发酵时间为3 d。
2.1.3 北五味子麦芽酵素发酵温度的确定
图3 发酵温度对酵素超氧化物歧化酶活力的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on superoxide dismutase activity in Jiaosu
由图3可知，SOD酶活力在35～39 ℃时变化不大，但当发酵温度到达41 ℃时，SOD酶活力迅速上升，达到了最大值3 177.94 U/mL。而在发酵温度高于41 ℃之后，SOD酶活力呈现大幅度的下降趋势。因此，选择植物乳杆菌的最适发酵温度为41 ℃。
2.1.4 北五味子麦芽酵素接种量的确定
图4 接种量对酵素中超氧化物歧化酶活力的影响
Fig.4 Effect of inoculum on superoxide dismutase activity in Jiaosu
由图4可知，随着乳酸菌接种量的不断增加，SOD酶活力表现出先上升后下降的趋势。当接种量达到1.5%时，SOD酶活力达最大值，为3 464.80 U/mL；当接种量＞1.5%时，SOD酶活力逐渐降低。其原因可能是由于接种量过大，菌体正常代谢消耗的营养物质较多，导致发酵产物减少。因此，选择植物乳杆菌的最适接种量为1.5%。
2.2 正交试验优化发酵工艺条件
以接种量、发酵温度、发酵时间为评价因素，SOD酶活力为评价指标进行正交试验，结果见表2。
表2 北五味子麦芽酵素发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Schisandra chinensis and malt Jiaosu fermentation condition optimization
由表2可知，对于SOD酶活力来说，影响该因素的主次顺序为发酵温度（A）＞接种量（B）＞发酵时间（C），由k值可知，北五味子麦芽酵素SOD酶活力最高的组合为A2B2C2，即发酵温度41 ℃，接种量1.5%，发酵时间3 d。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，北五味子麦芽酵素SOD酶活力为3 464.80 U/mL。
2.3 北五味子麦芽酵素抗氧化活性
为进一步明确北五味子麦芽酵素产品的抗氧化活性，测定了该酵素产品发酵前后对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力，结果见表3。
表3 发酵前后清除自由基能力的变化
Table 3 Changes of free radical scavenging ability before and after fermentation
由表3可知，发酵后超氧阴离子自由基的清除能力由发酵前的14.36%提高至发酵后的26.03%，但远低于4 mg/mL维生素C对超氧阴离子自由基的清除力（87.78%），这可能与SOD和酚类物质的上升有关；羟自由基清除率略有下降，但发酵前、后（99.54%、97.25%）均高于4 mg/mL维生素C对羟自由基清除率（73.21%）。北五味子麦芽酵素发酵后DPPH自由基清除率略有降低。这和KIM N J等[16]研究的马铃薯发酵饮料试验有相似的结论。
发酵液中的ABTS+自由基清除力比原液略有升高，由0.598 0 mmol/L升至0.613 7 mmol/L，但远低于4 mg/mL维生素C对ABTS+自由基的清除力（0.96 mmol/L）。可能是与发酵过程中SOD酶活力不断增加有关[17]，EREL O[18]的研究表明，酚类物质的浓度越高，其ABTS+自由基清除能力就越高。本试验结果也与蒋增良等[19-20]的研究结果一致。
3 结论
植物乳杆菌发酵制备北五味子麦芽酵素的最优工艺条件为：北五味子和麦芽的原料比为2∶1（g∶g），植物乳杆菌的接种量1.5%，在41 ℃的条件下发酵3 d，得到的酵素活性最高，SOD酶活力为3 464.80 U/mL；其对超氧阴离子自由基清除能力、羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和对ABTS+自由基清除能力分别达到了26.03%、97.25%、89.10%和0.613 7 mmol/L，表明该酵素具有较好的抗氧化活性。
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