酸奶作为最主要的发酵乳制品，因其具有特殊的风味和丰富的营养与保健价值，深受消费者的青睐[1]。近年来，我国酸奶的市场规模逐年上升，2017年销售额已达1 220亿元，首次超越牛奶，且每年仍以20%左右的速度快速增长，是最具发展潜力的乳制品之一[2]。然而，由于酸奶是经保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Strep tococcus thermophilus）共同发酵而制得的活菌型产品，在正常发酵结束后的贮藏、运输和消费过程中，酸奶的pH值会继续下降，出现后酸化现象，使产品酸味过重和感官质量下降，在一定程度上限制了酸奶产业的发展[3-4]。
目前，控制酸奶后酸化的主要方法有添加天然防腐剂、抑制剂等外源物，调整球杆菌比例，改善工艺水平，改变细胞膜的通透性，采用基因工程和人工诱变育种技术等[5-8]。其中，添加外源物、调整球杆菌比例、改善工艺水平等措施虽然能在一定程度上控制后酸化现象，但酸奶的特有风味和质量将大大降低[8-11]。彻底解决酸奶后酸化问题的关键是获得低温、低pH值条件下产酸弱的菌株，虽然基因工程技术在菌种的改良上具有显著效果，但由于合成乳酸的基因非常复杂，目前尚不是很清楚，因此，该方法很难实现[12-13]。而诱变育种尤其是离子注入诱变技术，因其具有育种速度快、操作简单及高效、高定向性、损伤轻、突变谱广等特点，因而在优良菌种的选育领域发挥着重要的作用[14-15]，然而，关于N+注入诱变技术在弱后酸化酸奶发酵菌种选育中的应用鲜有报道。另外，由于德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）保加利亚亚种是酸奶后期发酵的优势菌群，耐酸性较强，是导致后酸化的主要菌种[16-17]，因此，选育弱后酸化的保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），可有效解决酸奶的后酸化问题。
本研究以保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）DL1为出发菌株，采用低能N+注入诱变技术，并用青霉素处理，选育低pH值条件下产酸弱的菌株，以求有效解决酸奶后酸化问题。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与培养基
保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）DL1：本实验室筛选保藏；MRS液（固）培养基（pH值6.2）：北京奥博星生物技术有限责任公司；脱脂乳培养基：12%还原脱脂乳（雀巢），95 ℃灭菌10 min。
1.1.2 生化试剂
青霉素（纯度99%）：武汉易泰科技有限公司上海分公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
Model-1型多功能等离子体浸没离子注入装置：哈尔滨工业大学材料科学与工程学院；2120UV型紫外可见分光光度计：韩国美卡希斯有限公司；S210-B型酸度计：梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；CL-32L型自动高压灭菌器：日本ALP公司；TGL-16型台式高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 保加利亚乳杆菌DL1生长曲线的绘制
菌种活化：将实验室保存的保加利亚乳杆菌DL1接种于MRS液体培养基中，37 ℃、140 r/min条件下培养，按照3%（V/V）的接种量每24 h传代一次，共传代三次。
生长曲线的绘制：将活化后的保加利亚乳杆菌DL1接种于MRS液体培养基中，37 ℃、140 r/min条件下培养14 h。按2%（V/V）的接种量转接到MRS液体培养基中，装液量为30 mL/250 mL，37 ℃、140 r/min条件下摇床振荡培养，每隔2 h取出5 mL发酵液，适当稀释后测定其在波长600 nm处的吸光度值，绘制保加利亚乳杆菌DL1的生长曲线。
1.3.2 低能N+注入诱变处理
菌膜的制备：将活化后的保加利亚乳杆菌DL1接种于于MRS液体培养基中，37 ℃、140 r/min条件培养10～12 h，制成细胞浓度约为1×108 CFU/mL的菌悬液。取0.2 mL菌悬液涂布于无菌小培养皿内，无菌室下自然风干，镜检，菌体无重叠后进行N+注入。
N+注入诱变处理[14]：将菌膜置于N+注入机中，在真空度为0.6 Pa，注入能量为25 keV，注入剂量为0～2.5×1015ions/cm2的条件下进行氮离子注入，同时以真空为对照。诱变后用1mL无菌生理盐水洗脱小培养皿中的菌体，得到诱变后的菌悬液。菌悬液经梯度稀释、涂布培养后按平板菌落计数法[17]进行菌落计数，并计算不同注入剂量菌株的致死率，绘制致死率曲线，从中选取最佳注入剂量。致死率计算公式如下：
1.3.3 青霉素处理
参照HOFHERR L A等[18]的方法。将N+注入处理后的菌株制备成菌悬液，接种于MRS液体培养基中，37℃、140 r/min条件下培养12 h后，25 ℃条件下10 000×g离心10 min，收集菌体，悬浮于pH 4.3、含有2.0 mg/mL青霉素的MRS液体培养基中，42 ℃条件下分别处理1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。处理后，离心收集菌体，制备菌悬液，并采用平板菌落计数法进行菌落计数，以未经青霉素处理的为对照，计算致死率，其计算公式如下：
1.3.4 弱后酸化菌株的筛选
将青霉素处理后制备的菌悬液涂布于MRS固体培养基上，37 ℃培养48 h，挑选菌落分布均匀，且菌落数在100～300个之间的平板，通过平板印影法分别接种到pH值为4.3和4.8的MRS固体培养基中，用保鲜膜密封，37 ℃培养。选取在pH 4.8条件下生长，而在pH 4.3条件下不长或生长缓慢的菌落为目标菌株，并以出发菌株为对照，进行脱脂乳发酵及贮藏产酸实验，比较其在贮藏过程中pH值的变化。
1.3.5 菌株脱脂乳发酵产酸及后酸化验证
将初步筛选出的突变菌株传代2次，制作发酵剂。以出发菌株DL1为对照，接种于脱脂乳培养基中，在42 ℃条件下发酵8 h，每隔2 h测定pH值，观察其发酵产酸情况。待pH值至4.6时取出，于4 ℃冷藏12 h后置于25 ℃条件下保藏72 h，每隔12 h测定pH值，绘制72 h的pH值变化曲线，观察其贮藏过程中的酸度变化情况，筛选25 ℃保藏期间产酸慢的菌株。
1.3.6 遗传稳定性实验
将筛选出的突变菌株在MRS培养基中连续传8代，分别将第3代和第8代的菌株以2%（V/V）的接种量接种于脱脂乳培养基中，42 ℃条件下发酵，待pH值达4.6后，4 ℃冷却，25 ℃保藏72 h，每隔12 h测定pH值，以出发菌株DL1为对照，观察突变菌株遗传稳定性。
2 结果与分析
2.1 保加利亚乳杆菌DL1的生长曲线
诱变处理时，一般要求出发菌株应处于菌体生长状态同步、易于变异、重复性较好的对数生长期。考察保加利亚乳杆菌DL1的生长曲线，确定其对数生长期，结果见图1。
图1 保加利亚乳杆菌DL1的生长曲线
Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus DL1
由图1可知，保加利亚乳杆菌DL1在MRS培养基中启动较快，延迟期较短，4 h后进入快速生长的对数生长期，12 h后菌种生长趋于平稳，因此，确定保加利亚乳杆菌DL1的对数生长期为4～12 h。另外，为了增加可能变异的细胞数，需保证出发菌株具有一定的细胞浓度，因此，选择对数生长的中后期菌株进行诱变处理，即培养时间为10～12 h。
2.2 N+注入剂量对保加利亚乳杆菌DL1致死率的影响
图2 不同氮离子注入剂量下保加利亚乳杆菌DL1的致死率曲线
Fig.2 Lethality rate curve of Lactobacillus bulgaricus DL1 under different nitrogen ion implantation dose
由图2可知，在注入能量为25 keV，N+注入剂量为0～1.0×1015 ions/cm2条件下，随着注入剂量的增大，保加利亚乳杆菌DL1的致死率迅速升高，而N+注入剂量在1.0～1.5×1015 ions/cm2之间时，致死率随N+注入剂量的升高出现小幅度的降低，而后随着N+注入剂量的进一步升高致死率显著上升，致死率曲线呈现典型的“马鞍型”[14]。这主要是由于N+注入剂量较低时仅会损伤细胞表面，而随着N+注入剂量的增加，细胞膜上沉积离子的能量和质量可能会对细胞骨架造成破坏，并间接诱导核仁的损伤，导致细胞死亡，致死率迅速上升，当N+注入剂量进一步上升达到一定数量后，细胞的自我修复功能被激活，致死率有所降低，当N+注入剂量增加到引起的细胞复杂损伤超过细胞修复能力时，菌株致死率再次升高[19]。由于最佳的N+注入剂量应该在致死率曲线波谷区域，故确定保加利亚乳杆菌DL1的最佳N+注入剂量为1.5×1015 ions/cm2。
2.3 青霉素处理条件的确定
N+注入诱变处理后的菌液，经37 ℃培养10 h后，在pH 4.3、42 ℃条件下，经2.0 mg/mL青霉素处理不同时间的致死率见图3。
由图3可知，采用2.0 mg/mL的青霉素处理能选择性地杀死在42 ℃、pH 4.3条下生长的保加利亚乳杆菌，从而达到浓缩低pH值条件下不生长菌株的目的[18]。另外，GORINI L等[20]研究表明，青霉素对细菌的致死率在50%左右时，对菌株的浓缩效果最好。因此，采用2.0 mg/mL青霉素对诱变后的菌株在42 ℃条件下处理2 h。
图3 青霉素处理时间对诱变菌株致死率的影响
Fig.3 Effect of penicillin treatment time on lethality rate of mutant strain
2.4 弱后酸化突变菌株的筛选
在“印影”平板上挑取在pH 4.8条件下生长，而在pH 4.3条件下不长或生长缓慢的菌落35个，分别接种于脱脂乳试管中，42 ℃条件下培养，观察脱脂乳凝乳情况，直接淘汰不凝乳或凝乳较差的突变菌株26株。取凝乳效果较好的9株突变菌，分别标记为DL1-1～DL1-9，传代2次，制作发酵剂，以出发菌株DL1为对照进行后酸化验证试验，比较贮藏过程中各管的pH值变化。最终筛选出在25 ℃下产酸缓慢的突变菌株DL1-3。
2.5 突变菌株DL1-3在脱脂乳中发酵产酸能力
图4 42 ℃条件下菌株DL1及DL1-3在脱脂乳中的pH值变化
Fig.4 pH change of strain DL1 and DL1-3 in skimmed milk at 42 ℃
由图4可知，42 ℃条件下菌株DL1与DL1-3在脱脂乳培养基中发酵培养时，随着培养时间的增加pH值均逐渐下降，酸度增加。其中，突变菌株DL1-3的pH值下降速度较出发菌株DL1缓慢，尤其是在0～4 h，而4 h后突变菌株DL1-3的产酸量与出发菌株DL1逐渐接近，发酵培养6 h时，突变菌株DL1-3的pH值降至4.56，与出发菌株DL1的pH值没有显著差异（P＞0.05）。因此得出，42 ℃发酵12%脱脂乳时，虽然突变菌株DL1-3在前4 h产酸速度较慢，但4 h后产酸速度有所加快，6 h时与出发菌株DL1的产酸量差异较小。
2.6 突变菌株DL1-3发酵脱脂乳的后酸化性能
由图5可知，菌株DL1-3与DL1发酵脱脂乳在25 ℃条件下贮藏时，随贮藏时间的增加pH值均逐渐下降，但突变菌株DL1-3与出发菌株DL1相比，后酸化的程度在贮藏12 h后显著降低（P＜0.05）。其中，突变菌株DL1-3发酵脱脂乳在常温（25 ℃）条件下放置24 h，pH值仍能维持在4.1左右，贮藏72 h时pH值下降0.78，此时，pH值的降低（后酸化）程度比出发菌株DL1降低了18.8%。
图5 菌株DL1-3和DL1发酵脱脂乳在25 ℃条件下贮藏时的pH值变化
Fig.5 pH Change of skimmed milk fermented by strain DL1-3 and DL1 during storage at 25 ℃
2.7 突变菌株DL1-3的遗传稳定性
将突变菌株DL1-3在MRS培养基中连续传代8次，考察突变菌株DL1-3第3代与第8代发酵脱脂乳的后酸化性能，结果见图6。
图6 突变菌株DL1-3第3代与第8代发酵脱脂乳在25 ℃条件下贮藏时pH值的变化
Fig.6 pH change of skimmed milk fermented by the third and eighth generations of mutant strain DL1-3 during storage at 25 ℃
由图6可知，突变菌株DL1-3第3代和第8代发酵脱脂乳在25 ℃条件下贮藏时，pH变化曲线没有显著差异（P＞0.05）。结果表明，突变菌株DL1-3具有良好的稳定遗传性能。
3 结论
采用低能N+注入技术，以保加利亚乳杆菌DL1为出发菌株，在最佳注入剂量（1.5×1015 ions/cm2）的条件下进行诱变，并用2.0 mg/mL青霉素处理2 h，通过筛选获得一株后酸化能力较弱的突变菌株DL1-3，其后酸化程度比出发菌株DL1降低18.8%，且在42 ℃条件下发酵脱脂乳的产酸能力与出发菌株DL1差异较小，同时具有良好的遗传稳定性。
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