酵母菌在世界各地的许多传统发酵食品和饮料的生产中均扮演着重要的角色[1]，并代表了该地区的饮食文化。酵母菌是一种单细胞真菌，属于兼性厌氧菌，其对营养要求低，繁殖速度快，能够利用食品原料中的碳水化合物发酵生成醇类化合物和二氧化碳等[2]。酵母菌在食品发酵过程中可以通过代谢产物和菌体自溶改良原材料的感官、营养和物理性质等，赋予发酵食品独特的风味[3]。现今，酵母被广泛应用于面包[4]、开菲尔[5]和酒精类饮料等[6-7]发酵食品。
传统发酵蓝莓饮料主要采用自然发酵的方式，利用水果果皮、环境或地域等天然存在的微生物作为发酵菌株[8]，通过微生物间的优胜劣汰来完成发酵。其中主导发酵的真菌多为酵母菌[9]，但仍存在一些杂菌和少数致病菌，给食品安全带来风险。自然发酵的方法存在发酵工艺不易控制和成品品质参差不齐等缺点。利用生物学手段从自然发酵的蓝莓饮料中分离筛选出发酵性能优异的菌株，对于蓝莓相关产品的研究开发、产品生产和质量控制以及产品安全性方面都具有实际意义[10]，并可为后续研究发酵机理和功能成分代谢提供了理论基础。
本研究从传统发酵蓝莓饮料中分离出酵母菌，通过形态学鉴定、ITS序列分析及生理生化试验等，对酵母菌进行菌种鉴定及筛选，旨在对后期蓝莓发酵产品的研制提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
传统发酵蓝莓饮料A、B、C（鲜果加水补糖，密封自然发酵而得）：黑龙江省伊春市。
孟加拉红培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液体培养基：北京陆桥技术股份有限公司；真菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：TIANGEN生化科技（北京）有限公司。
1.2 仪器与设备
DN-117M数码生物显微镜：宁波永新光学股份有限公司；FE-28 pH计：瑞士梅特勒公司；HVA-110高压灭菌器：日本HIRAYAMA公司；Gel Doc XR+凝胶成像仪、Sub-Cell GT电泳仪：美国Bio-Rad公司；5804 R离心机：德国Eppendorf公司。
1.3 方法
1.3.1 样品DNA提取及16S rDNA测序
将传统发酵蓝莓饮料样品送至天津诺禾致源生物信息科技有限公司，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium ammonium bromide，CTAB）法[11]提取样品DNA，以ITS 5-1737F和ITS 2-2043R为引物扩增真菌ITS 1区序列，并进行高通量测序文库的构建和Ion S5 XL平台的单端测序。
1.3.2 酵母菌的分离纯化及保种
试验方法参考陈源源[12]的方法略有改动，具体如下：将传统发酵蓝莓饮料样品等梯度稀释后涂布于含有孟加拉红培养基的无菌平板上，（28±1）℃厌氧培养5 d。挑取平板上无菌丝体的菌落进行三区划线，重复3次，得到纯化菌株。将纯化后的菌株接入YPD液体培养基中，28 ℃过夜静置培养。吸取10 μL该菌液再接入YPD液体培养基中重复培养3次后，进行保种及后期菌种鉴定。
1.3.3 酵母菌形态学分析与分子生物学鉴定
对菌株进行菌落特征观察和细胞形态观察[14]。
参照TIANGEN基因组DNA提取试剂盒[13]说明书进行DNA提取。以DNA为模板进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，引物分别为ITS 1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS 4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）[15]。经琼脂糖凝胶电泳检测，将条带清晰且单一[16]的PCR产物送至金维智生物科技有限公司进行测序。序列比对采用GenBank中的BLAST进行分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。
1.3.4 酵母菌初筛
利用Geneious软件将酵母菌纯化菌株的DNA序列与样品ITS高通量测序中所有操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）代表序列进行比对，选出与酵母菌的OTU代表序列匹配度为100%的菌株。
1.3.5 酵母菌复筛
（1）产气试验
试验方法参考匡钰等[17]的方法略有修改，具体如下：使用杜氏小管发酵法，进行酵母菌产气试验。将活化后的酵母菌液以7%（V/V）的接种量接入装有10 mL YPD液体培养基的试管中，并放入杜氏小管，于30 ℃条件下静置培养，每隔8 h观察其杜氏小管中气泡的大小。
（2）产乙醇试验
样品制备：将冻藏蓝莓解冻，以1∶1（V/V）的比例加入纯水，榨汁备用。取10 mL酵母菌液于离心管中，5 000 r/min离心5 min，弃上清液，用生理盐水冲洗沉淀物，除去残留的培养基。将菌体用生理盐水悬浮，以3%的接种量接入蓝莓果汁中，26 ℃条件下培养10 d[18]后，取2 mL发酵液适当稀释，10 000 r/min离心5 min，取上清过滤（0.22 μm水系微孔滤膜）后，进行高效液相色谱分析，每个样品重复3个平行。
乙醇标准溶液配制：准确吸取10 mL乙醇标品于100 mL容量瓶，加水定容至刻度线，充分混匀，得到10%乙醇标准溶液。取适量10%乙醇标准溶液进行梯度稀释（5%、4%、3%、2%和1%）。
色谱条件：色谱柱为Aminex
HPX-87C（300mm×7.8mm）；流动相为超纯水；洗脱方式为等梯度洗脱；流速为0.5mL/min；进样量为20 μL；柱温为65 ℃；检测器温度为60 ℃；检测器为示差折光检测器[19]。
1.3.6 酵母菌发酵蓝莓果汁的生长能力
取终点发酵液进行pH值的测定和酵母菌活细胞计数[20]。
1.3.7 数据分析
利用Excel 2016、SPSS Statistics 20.0软件进行数据处理和分析。
2 结果与分析
2.1 传统发酵蓝莓饮料的物种相对丰度
分析传统发酵蓝莓饮料中的微生物组成可以更好地控制生产工艺以及成品质量，通过ITS高通量测序得到传统发酵蓝莓饮料中真菌属水平物种相对丰度，结果如图1所示（仅展示相对丰度排名前十的物种）。由图1可知，传统发酵蓝莓饮料真菌属水平物种相对丰度中，只有德克酵母（Dekkera）、毕赤酵母（Pichia）和伊萨酵母（Issatchenkia）相对丰度＞1%。其中德克酵母（Dekkera）在各样品中的相对丰度介于87.3%～92.2%之间，均值为89.3%，相对丰度排名第一，菌群优势明显。据研究显示，德克酵母（Dekkera）可以适应恶劣或受限（如较高的乙醇浓度、较低的pH值和较差的氮源）的环境条件[21]，适宜的生长温度在19～35 ℃之间[22]，这些可能是其在传统发酵蓝莓饮料中菌群优势明显的主要原因。此外，德克酵母（Dekkera）还对一些啤酒和葡萄酒的风味和香气具有一定的贡献[6]。毕赤酵母（Pichia）和伊萨酵母（Issatchenkia）在各样品中的相对丰度分别为4.3%～7.9%和0.7%～2.5%，均值分别为6.3%和1.4%，显然这两种酵母菌并不是主要的发酵菌，可能在发酵过程中与发酵菌协同完成发酵，有报道显示，毕赤酵母（Pichia）作为非酿酒酵母菌参与了葡萄酒的发酵[23]，伊萨酵母（Issatchenkia）在葡萄酒发酵中可以增加单萜含量，有助于葡萄酒的香气[24]。
图1 传统发酵蓝莓饮料属水平物种相对丰度
Fig.1 Relative abundance of species in traditional fermented blueberry beverages at genus level
2.2 形态学分析
通过分离纯化得到部分纯化菌株的菌落和细胞形态，如图2所示。由图2可知，a、b和c中菌落为圆形，边缘整齐，菌落中心隆起，菌落为红色，不透明，无菌丝，是典型的酵母菌菌落；d中菌体细胞呈卵圆形，大小不一，无菌丝；e中菌体细胞呈梭状，无菌丝；f中菌体细胞呈棒状，无菌丝；e和f中均可找到正在进行分裂的细胞。
图2 酵母菌的菌落形态和细胞形态
Fig.2 Colony and cell morphology of yeasts
2.3 酵母菌分子生物学鉴定结果
以纯化酵母菌菌株基因组DNA为模板，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图如图3所示。由图3可知，ITS扩增产物介于750～1 000 bp之间，产物的电泳条带单一且清晰，满足测序要求。
经过孟加拉红平板划线分离，共得到30株疑似酵母菌菌株。将30株菌株的测序结果与GenBank中已知序列进行同源性比对，确定测序菌株的属水平信息，结果汇总于表1。由表1可知，30株疑似酵母菌菌株中，德克酵母（Dekkera）共10株，编号分别为YA 1～YA 4、YA 8～YA 10、YB 2、YB 3和YC 10；毕赤酵母（Pichia）共10株，编号分别为YB 6、YA 5和YC 2～YC 9；伊萨酵母（Issatchenkia）共5株，编号分别为YB 4、YB 5和YB 7～YB 9；假丝酵母（Candida）共5株，编号分别为YB 1、YB 10、YA 6、YA 7和YC 1。本次分离鉴定得到的菌种在传统发酵食品中均有过相关报道[21-24]，可继续进行筛选试验。
图3 酵母菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig.3 Electrophoretogram of PCR products of yeasts
表1 纯化酵母菌的ITS基因序列鉴定结果
Table 1 Identification results of purified yeasts by ITS gene sequences
2.4 酵母菌初筛
将上述30株酵母菌ITS序列与高通量测序得到的OTU代表序列进行BLAST比对。筛选与相对丰度Top 10操作分类单元的代表序列匹配度为100%的菌株进行后续试验，筛选结果见表2。由表2可知，共筛选出5株酵母菌，其菌株编号分别为YA 1、YA 8、YB 6、YB 8和YC 5。这5株酵母菌作为后续酵母菌复筛试验的试验菌株。
表2 酵母菌初筛结果
Table 2 Preliminary screening results of yeasts
2.5 酵母菌复筛
2.5.1 酵母菌产气能力
通过酵母菌产气能力试验可以筛选出发酵性能良好，起酵速度快且生长旺盛的菌株，试验结果汇总于表3。由表3可知，5株酵母的3次产气试验结果完全一致，均为阳性。其中菌株YA 1与YB 8在培养8 h左右，已有气体产生；其他3株酵母菌均在培养16 h左右，开始产气；在培养至24 h时，所有菌株产气均充满杜氏小管。可以看出5株酵母菌都具有一定程度的产气能力，其中菌株YA1与YB8的产气能力相对较强。5株酵母菌的产气能力均高于匡玉等[18，25]的报道。
表3 酵母菌的产气能力
Table 3 Gas production ability of yeasts
注：“-”表示未产气，“+”表示产气量小于杜氏管的1/2，“++”表示产气量大于杜氏管的1/2，“+++”表示产气量充满整个杜氏管。
2.5.2 酵母菌产乙醇能力
将5株酵母菌分别投入蓝莓果汁中进行发酵，通过高效液相色谱法检测发酵后的乙醇含量，以确定酵母菌在蓝莓果汁体系中的产乙醇能力，发酵液的高效液相色谱图结果见图4，酵母菌产乙醇能力的结果见图5。
图4 不同酵母发酵液的高效液相色谱图
Fig.4 HPLC chromatogram of fermentation broth of different yeasts
图5 酵母菌的产乙醇能力
Fig.5 Ethanol production ability of yeasts
由图5可知，5株酵母菌的发酵液中均有乙醇检出。菌株YA 1、菌株YB 6和菌株YB 8所得到的乙醇含量最高，分别为9.73%、8.93%和9.55%；菌株YA 8和菌株YC 5次之，为6.77%和7.19%。可见，5株酵母菌作为蓝莓果汁发酵菌株都有一定的产乙醇能力。由于蓝莓果汁中含酸量较高，一般酵母菌不易生长[19]，对菌株进行针对性驯化后，可应用于蓝莓果酒发酵。
2.6 酵母菌发酵蓝莓果汁的生长状态
由于蓝莓果汁pH值较低，可能会抑制一些酵母菌生长。因此需要考察酵母菌在蓝莓果汁中的生长能力，以反映其对低pH值的耐受情况。将5株酵母菌接入蓝莓果汁中进行发酵，测定10 d时各菌株的活细胞数量和pH值，结果见表4。由表4可知，发酵10 d时，发酵液pH值均在2.6左右，活菌数＞108CFU/mL的菌株有YA 1和YB 8，其余3株菌株（YA 8、YB 6和YC 5）的活菌数均＜108 CFU/mL。酵母菌在蓝莓果汁中的活菌数量与孙炜宁等[26]报道相似，略高于吴启凤等[27]报道的pH 2.0条件下酵母菌存活情况。由以上结果可以看出，菌株YA 1和YB 8在蓝莓果汁中的生长能力相对较强。
表4 酵母菌发酵蓝莓果汁的活细胞计数和pH值
Table 4 Viable yeast cell count and pH of fermented blueberry juice
注：同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
3 结论
本研究通过高通量测序技术对传统发酵蓝莓饮料样品进行分析，发现德克酵母（Dekkera）为主要真菌发酵菌属。进一步利用微生物方法对传统发酵蓝莓饮料中的酵母菌进行分离，共得到30株酵母菌。利用分子生物学手段对纯化菌株进行鉴定及初步筛选，有5株与传统发酵蓝莓饮料中相对丰度最高的酵母菌操作分类单元代表序列完全匹配。在产乙醇能力的测试中，YA 1、YB 6和YB 8三株酵母菌表现出较强的产乙醇能力。YA 1和YB 8两株酵母菌在产气能力测试和蓝莓果汁发酵中均表现优异。综上所述，属水平注释信息为德克酵母（Dekkera）YA 1和伊萨酵母（Issatchenkia）YB 8的更适合应用于发酵蓝莓果汁。
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