苦瓜（Momordica charantial）是葫芦科苦瓜属一年生攀援状柔弱草本植物，又名凉瓜、癞瓜、君子菜、锦荔枝等，广泛种植于热带亚热带国家，栽培历史悠久。可药食兼用、性味苦寒、清心明目，素有“药用蔬菜之称”[1-3]。苦瓜中除了含有丰富蛋白质，脂类和维生素外，还有特殊的化学成分，如凝集素，苦瓜素，苦瓜抑制剂，苦瓜皂苷等[4-5]。保健酒是指对人体具有保健作用的饮料酒，在中国有着悠久的历史。随着生活水平的提高，人们对健康越来越重视，保健酒兼具保健及酒类特点，其发展迎来了重大的机遇期，近年来成为了食品饮料行业的研究热点。
皂苷是存在于自然界中一种天然物质，自然界许多植物里含有皂苷成分。如大豆、桔梗、人参、柴胡、三七、苦瓜、麦门冬、木通、茶叶等均含有皂苷。苦瓜皂苷占苦瓜干物质质量分数的4%，大部分属于三萜类[6-7]。苦瓜中的三萜皂苷主要包括葫芦素烷型四环三萜和乌苏酸型五环三萜[8]。现代研究证实，苦瓜皂苷具有降血糖、抗氧化、抗病毒、降低胆固醇、养血滋肝和抑菌的功效[9-15]。近年来国内外学者对微生物法转化人参皂苷做了深入的研究。植物乳杆菌对皂苷有较高的转化效率，可作为酿造功能性酒品的发酵菌种[16]。
该研究以苦瓜汁和果蔬汁为原料酿酒，对其发酵工艺进行优化，筛选出感官评价最好、测定其皂苷含量及酒精度，并研究其抗氧化活性，旨在找出苦瓜酒的保健功能，为苦瓜的深加工及功能性食品的开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验材料
苦瓜、金冠苹果、菠萝、白砂糖：市售；植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）：武汉欣欣佳丽生物科技有限公司；偏重亚硫酸钾：上海展云化工有限公司；果胶酶（5万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；MRS培养基：青岛海博生物技术有限公司。
1.1.2 试剂
人参皂苷Rg1标准品（纯度为98.85%）：抚顺市食品药品检验所。抗坏血酸、硫酸亚铁、三氯化铁、香草醛、冰乙酸、高氯酸、无水乙醇、甲醇、三氯乙酸、盐酸等均为分析纯：广州化学试剂厂。所有水均为双蒸水。
1.2 仪器与设备
MC型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；SB25-12DTDN超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司；RE-52B旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；TD5A-WS台式低速离心机：上海卢湘仪宜仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；XPX-9052MBE电热恒温培养箱：上海博讯业有限公司医疗设备厂；FD-1E-50冷冻干燥机：上海比朗仪器有限公司；UV-721型可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；DL102电热鼓风干燥箱：天津市实验仪器厂；SJ03-250苏泊尔多功能搅拌机：浙江苏泊尔股份有限公司；FA1004电子分析天平：上海民桥精密科技仪器有限公司；0-40度酒精计：康华仪器仪表厂。
1.3 试验方法
1.3.1 苦瓜保健酒酿造工艺流程
新鲜水果→去皮去核→切块榨汁→加偏重亚硫酸钾→加果胶酶→静置24 h→取上清液→与苦瓜汁混合→活化菌种→加菌种→加糖→主发酵→倒灌→后发酵→下胶→成品
1.3.2 操作要点
原料挑选：选取成熟度适宜、表皮完好的新鲜水果及肉质厚、成熟度适中、外皮青绿色、无病斑、无机械伤的苦瓜，剔除质量不佳的原料。
破碎榨汁：苹果去核，菠萝去皮，切成小块分别用榨汁机榨碎后果汁以1∶1混匀。
添加试剂：为防止苹果氧化应迅速灌装或在榨汁过程中按100 L加入12～20 g偏重亚硫酸钾，再添加质量分数为0.04%的果胶酶以保证出汁率与澄清度，静置24 h使果胶酶充分作用于原液。加糖时，用果汁溶解后再将其均匀撒入发酵液中，以保证发酵体系中糖浓度的均衡。
苦瓜汁的制作：将苦瓜清洗，剖分去籽，再将苦瓜破碎成1 cm3左右的瓜丁，于沸水中漂烫2 min，立即冷却，沥干，打浆。浆液中添加0.02‰的Na2SO3，冷藏备用。
菌种活化：酵母菌用37 ℃果汁活化30 min；植物乳杆菌活化：用无菌吸管吸取1 mL已灭菌的常温乳酸细菌培养基（MRS）液体，移至菌种管内，轻微充分振荡，将冻干乳酸菌体溶解成悬浮液状，取约0.5 mL的菌液MRS固体培养基上，37 ℃静置培养36 h，连续培养三代后再进行划线培养，待长出单菌落后，挑选生长旺盛的单菌落。将生长旺盛的单菌落接种到已灭菌的MRS基础培养基中扩大培养，37 ℃静置培养36 h，即得菌液，备用[16]。
主发酵与后发酵：将活化好的菌种固定酵母菌添加量为0.1%，混合乳酸菌一起加入发酵液后封闭罐口，于24 ℃环境（波动不大于5 ℃）发酵一周，每日早晚监测温度。一周后（即主发酵结束）立即倒罐，弃下层沉淀。倒罐后加少量偏重亚硫酸钾，在10 ℃条件下密封陈酿一个月。
下胶：采用蛋清下胶，用量为每1 000 L果酒20个蛋清。
1.3.3 单因素试验
（1）果汁与苦瓜汁比例对苦瓜保健酒的影响：固定酵母添加量为1 mL/L，乳酸菌添加量为5 mL/L，发酵温度为28 ℃，发酵时间为10 d，苹果菠萝汁与苦瓜汁比例分别为1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，以酒精度、感官评分及皂苷含量为评价指标对苦瓜保健酒进行综合评价。
（2）发酵时间对苦瓜保健酒的影响：固定苹果菠萝汁与苦瓜汁比例为1∶2，酵母添加量为1 mL/L，乳酸菌添加量5 mL/L，发酵温度为28 ℃，发酵时间分别为5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d，以酒精度、感官评分及皂苷含量为评价指标对苦瓜保健酒进行综合评价。
（3）菌种添加量对苦瓜保健酒的影响：固定发酵温度为28 ℃，发酵时间为10 d，果汁与苦瓜汁比例为1∶2，固定酵母菌添加量为1 mL/L，乳酸菌添加量分别为3 mL/L、4 mL/L、5 mL/L、6 mL/L、7 mL/L、8 mL/L、9 mL/L，以酒精度，感官评分及皂苷含量为评价指标对苦瓜保健酒进行综合评价。
（4）发酵温度对苦瓜保健酒的影响：固定果汁与苦瓜汁比例为1∶2，酵母添加量为1 mL/L，乳酸菌添加量为5 mL/L，发酵时间为10 d，发酵温度分别为17.5 ℃、20 ℃、22.5 ℃、25 ℃、27.5 ℃、30 ℃、32.5 ℃，以酒精度，感官评分及皂苷含量为评价指标对苦瓜保健酒进行综合评价。
1.3.4 响应面试验设计
响应面试验数据采用Design-Expert.V8.0.6.1软件进行分析处理。以感官评分为响应值，选择果汁与苦瓜汁比值、发酵时间、菌种添加量和发酵温度为影响因素，响应面试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization
1.3.5 苦瓜酒皂苷含量的测定方法及标准曲线的绘制
称取人参皂苷Rg1标准品10 mg加甲醇溶液定容至10 mL之后摇匀，得1 g/L的人参皂苷标准液。准确吸取对照品溶液0、40、80、120、160、200、240 mL于500 mL具塞试管中，在70 ℃水浴挥干溶剂。先加入5%的香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL，高氯酸0.6 mL。摇匀，于70 ℃水浴锅闭口加热振荡20 min，取出后用冰水冷却至0 ℃。加入冰乙酸5 mL稀释，摇匀，静置15 min。以甲醇溶液为空白对照，在波长550 nm处测吸光度值。以波长550 nm处测得的吸光度值y为纵坐标，人参皂苷Rg1的取样量x为横坐标，绘制出标准曲线，得到标准曲线回归方程为：y=0.002 8x-0.001 3，相关系数R2=0.994 6。
取适量的苦瓜保健酒置于10 mL的具塞试管中，在水浴中挥干溶剂，以甲醇溶液为空白对照，在可见分光光度计550 nm处测得吸光度值，并按公式（1）计算苦瓜皂苷提取率。
式中：1为人参皂苷标准溶液的质量浓度，g/L；x为从标准曲线得到待测液的取样量，L；V为定容体积，L；v为实际待测液取样量，L；M为苦瓜粉质量，g。
1.3.6 酒精度的测定
利用酒精计测定酒精度。
1.3.7 感官评定
感官指标：混合果酒呈嫩绿色，果香与酒香味搭配和谐，芳香醇和，无异味，澄清有光泽，符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》的要求。对混合果酒进行感官评定（满分100分），感官评定标准见表2。
表2 果酒感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fruit wine
1.3.8 抗氧化活性的测定
（1）苦瓜保健酒对羟自由基的清除作用
将苦瓜保健酒用蒸馏水配制为质量浓度为0.30 mg/mL、0.60 mg/mL、0.90 mg/mL、1.20 mg/mL、1.50 mg/mL、1.80 mg/mL的样液，分别吸取1.2 mL样品溶液于具塞试管中依次加入4 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液，3 mL 1 mmol/L H2O2溶液，轻轻摇匀，再加入4 mL 5 mmol/L水杨酸溶液，在38 ℃水溶锅中振荡加热55 min，取出自然冷却至室温，最后测吸光度值A1，同时如上操作，用3 mL蒸馏水代替3 mL H2O2溶液测吸光度值，记录为A2，用蒸馏水代替样液作为空白对照，吸光度值为A0，同时以VC作阳性对照。羟自由基清除率计算公式如下：
（2）苦瓜保健酒还原Fe3+能力的测定
将苦瓜保健酒用蒸馏水配制为质量浓度为0.30 mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg/mL、1.20mg/mL、1.50mg/mL、1.80 mg/mL的样液，分别吸取2 mL样品溶液于具塞试管中，依次加入1.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液和1.5 mL 1%铁氰化钾溶液（K3Fe（CN）6），于50 ℃水浴中保温20 min后在冰浴中快速冷却，再加入2 mL10%三氯乙酸溶液，以3 000 r/min的转速离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2 mL蒸馏水，0.4 mL 0.1%三氯化铁，充分混匀，静置12 min后，在波长700 nm条件下测定其吸光度值（以蒸馏水为参比溶液），同时以VC作为标样，操作同上。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 混合果汁与苦瓜汁比例对苦瓜保健酒的影响
图1 混合果汁与苦瓜汁比例对苦瓜酒的影响
Fig.1 Effect of the proportion of compound fruit juice to Momordica charantia juice on M.charantia wine
由图1可知，随混合果汁比例的增大，苦瓜酒的酒精度增加，在添加比为3∶1时达到最高，是由于苹果和菠萝的含糖量高于苦瓜，在发酵时能够形成更高的酒精度。当混合果汁∶苦瓜汁添加比为1∶5、1∶4、1∶3、1∶2时，酒体的苦味重，果香味较淡。当添加比为2∶1和3∶1时，酒体无苦瓜感官特征，果香味浓。当苹果菠萝混合果汁与苦瓜汁添加比为1∶1时，苦瓜酒的感官评分最佳。总皂苷含量随苦瓜用量的减少呈下降趋势，当苦瓜汁含量低于50%时皂苷含量明显下降。因此，苹果菠萝混合果汁与苦瓜汁添加比为1∶1时效果最佳，此时感官评分为86分，酒精度为10.8%vol，皂苷含量为2.26%。
2.1.2 发酵时间对苦瓜保健酒的影响
图2 发酵时间对苦瓜酒的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on Momordica charantia wine
由图2可知，随着发酵时间的延长，酒精度增加后保持平稳，10 d以前变化明显，10 d后基本趋于稳定，说明发酵已经结束。在发酵时间为5 d时，果香较重，酒香较淡。20 d以后苦瓜酒产生较重酸味，感官评分明显下降。在发酵10～20 d时，感官评定趋于稳定，10 d时感官评分最佳。总皂苷含量在发酵过程中呈上升趋势，10 d前较为明显，10 d后趋于平缓，说明皂苷含量已接近最大值。因此，发酵时间为10 d时效果最佳，此时感官评分为90分，酒精度为11%vol，皂苷含量为2.71%。
2.1.3 乳酸菌添加量对苦瓜保健酒的影响
图3 乳酸菌添加量对苦瓜保健酒的影响
Fig.3 Effect of lactic acid bacteria inoculum on Momordica charantia wine
由图3可知，随着发酵的进行酿酒酵母生成的酒精量增多，乳酸菌用量在3～6 mL/L范围内变化明显，超过6 mL/L时酒精度趋于稳定，是由于过量的乳酸菌抑制了酵母菌的发酵作用。当乳酸菌添加量为3 mL/L时，酒体的果香和菜香较浓，苦味较重，酒香较淡，当乳酸菌添加量为7～9 mL/L时，乳酸味稍明显，影响了酒的味道。随着乳酸菌添加量的增大，总皂苷含量增加，在添加量为3～5 mL/L时变化明显，超过5 mL/L时皂苷含量变化趋于平稳，说明皂苷积累量已经接近最大值。因此，乳酸菌添加量为6 mL/L时效果最佳，此时感官评分为84分，酒精度为9.5%vol，皂苷含量为2.71%。
2.1.4 发酵温度对苦瓜保健酒的影响
图4 发酵温度对苦瓜酒的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on Momordica charantia wine
由图4可知，随着发酵温度的升高，酒精度逐渐增大，菌种表现出较好的发酵活力。当发酵温度超过25 ℃时，酒体香气流失过多，口感不细腻，感官评分呈下降趋势。当发酵温度为25 ℃时，感官评分达到最大值，此时酒体色泽饱满鲜亮，香气浓郁。随着温度的升高，总皂苷含量增加，说明在较高温度下乳酸菌对皂苷有较高的转化效率。当发酵温度为25 ℃时，效果最佳，此时感官评分为92分，酒精度为11.3%vol，皂苷含量为2.62%。
2.2 苦瓜保健酒发酵的响应面试验优化结果
在单因素试验的基础上，按响应面试验设计方案，果酒发酵结束后分别对酒精度、感官评分及皂苷含量测定，以皂苷含量为评价指标的测定结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation conditions optimization
续表
利用Design Expert软件对表3中的响应值进行二元回归拟合分析，建立回归方程预测模型：
表4 回归模型各项方差分析
Table 4 Variance analysis of regression equation
注：“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）。
由表4可知，二次回归模型的F=66.20，P＜0.000 1，说明苦瓜保健酒中皂苷含量（Y）与4个因素之间的回归方程极显著。失拟项P=0.068 4＞0.05，说明失拟项不显著。响应面优化拟合出的方程回归项的模型P＜0.05，有显著性差异，失拟项（P=0.671 7＞0.05）差异不显著。
试验模型的决定性系数R2=0.984 1，说明皂苷得率的结果与预测值结果有良好的一致性，校正决定系数
，表示试验结果有96.92%受试验因素影响。此外模型的响应值变异系数（coefficient of variation，CV）值为3.99%，说明模型的重现性好，所以此模型可以用于分析和预测苦瓜保健酒中的皂苷含量。同时从表4中还能看出，D、AB、BC、A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），AC、AD、BD、CD对结果影响显著（P＜0.05）。回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响，由此，可以看出4个因素对苦瓜保健酒中的皂苷含量的影响大小排列顺序为：发酵温度＞发酵时间＞菌种添加量＞果蔬汁比例。
2.3 三维响应面和等高线分析
以皂苷含量为评价指标，AB、BC的交互作用对苦瓜酒皂苷含量影响的结果见图5。从图5（a）可以看出AB曲面图最陡，二者的相互影响作用最为显著。随着发酵时间（B）和果蔬汁比例的增大，皂苷的含量先上增大后基本保持不变，说明苦瓜酒中的皂苷己经趋于最大值。图5（b）中随着发酵温度（B）和菌种添加量（C）的增加，皂苷的含量均呈现先增大，达到最高值时又快速减小的趋势。说明发酵温度或菌种添加量过大会对皂苷含量带来负面影响，推测可能是由于提高温度也许会破坏苦瓜皂苷之间的糖苷键，影响产率，而添加菌种过多也许会积累其他中间代谢产物，影响苦瓜保健酒中的皂苷含量。
图5 各因素交互作用对皂苷含量影响的响应面和等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction of each factors on saponins content
2.4 最佳工艺条件的预测与检验
通过软件对所建立的模型进行分析，预测酿造苦瓜保健果酒的最优工艺条件为混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1，发酵时间为10 d，菌种添加量6.06 mL/L，发酵温度为26.18 ℃。此条件下酿得的果酒皂苷含量可高达2.81%。考虑到实际操作的可行性，在苹果菠萝混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1，发酵时间为10 d，菌种添加量6 mL/L，发酵温度为26 ℃的条件下进行5次平行性试验，所测得的皂苷含量平均值为2.78%，与理论预测值相差极小，说明试验中的回归方程适合于苦瓜保健酒酿造工艺的预测与分析。
2.5 苦瓜保健酒的抗氧化活性研究
2.5.1 产品清除羟自由基的能力
通过对苦瓜保健酒和VC进行不同程度的稀释，测定其羟自由基清除率，结果见图6。由图6可知，随着苦瓜皂苷质量浓度的增加，对·OH清除能力也随增强。虽然清除率略低于VC，但其增强趋势与VC相似，对羟自由基的清除率与皂苷的质量浓度成正相关，表明苦瓜保健酒对·OH有一定的清除能力。
图6 苦瓜保健酒清除羟自由基能力
Fig.6 Scavenging ability of Momordica charantia health wine on hydroxyl free radicals
2.5.2 产品还原Fe3+能力的测定
苦瓜保健酒和VC对Fe3+的还原能力结果见图7。由图7可知，随着质量浓度的增加，吸光度值逐渐升高，所表现的还原能力越强。在0.03～0.18 g/L质量浓度范围内，皂苷的吸光度值与质量浓度成正相关，相关系数为0.969 9，相关性极显著。说明苦瓜皂苷为良好的电子供应者，可参与自由基反应。但与VC相比，皂苷还原能力较弱。
图7 苦瓜保健酒还原Fe3+能力
Fig.7 Reduction capacity of Momordica charantia health wine on Fe3+
3 结论
本研究在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化发酵工艺条件，结果表明，苦瓜保健酒的最佳发酵工艺条件为混合果汁∶苦瓜汁=1.5∶1、发酵时间10 d、酵母添加量为1 mL/L、乳酸菌添加量6 mL/L、发酵温度26 ℃，在此条件下成品果酒的颜色呈亮嫩绿色，酒体澄清，果香协调，香气宜人，皂苷含量高达2.78%，酒精度为11.2%vol，感官评分达到90分。以VC作为阳性对照，采用清除羟自由基和还原Fe3+的能力分析苦瓜保健酒的抗氧化活性，结果表明，苦瓜酒有一定的抗氧化活性，并且与皂苷质量浓度呈正相关。
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