黑木耳（Auricularia auricula）别名云耳、树耳，是一种药食同源的食用菌。含有蛋白质、脂肪、碳水化合物和多种维生素与无机盐，其中蛋白质的含量相当于肉类，维生素B2含量超过米、面、蔬菜和肉类，铁的含量比肉类高100倍，钙的含量是肉类的30～70倍，还含有磷和硫等构成人体细胞原生质的主要成分，因此被誉为“素中之荤”[1]。此外黑木耳中所含有的多种矿物质元素还能使体内的各种结石产生化学反应，使结石剥脱、瓦解，不断脱屑缩小，然后再经管道排出[2]。传统中医认为黑木耳有滋润强壮、清肺益气、补血活血、镇静止痛等功效[3]，现代医学研究发现，黑木耳中含有多糖[4]、多酚[5]、黄酮[6]、黑色素[7]及膳食纤维[8]等活性成分，具有抗氧化[9]、抗肿瘤[10]、抑菌[11]、降血糖[12]、护肝[13]及预防动脉粥样硬化[14]及抗血小板聚集、防止血栓形成[15]等多种生物活性，被人们称为“食品阿司匹林”。
米酒含有丰富的维生素、葡萄糖、氨基酸等营养成分，能促进新陈代谢，具有补血养颜、舒筋活络、强身健体和延年益寿的功效，是老幼均宜的营养佳品。
随着人们生活水平的提高，对保健食品的需求越来越多，本研究拟将长白山优质资源黑木耳与糯米进行综合开发，利用糯米发酵中糖化酶及蛋白酶将黑木耳中的各种高分子物质体外酶解成人体易于吸收的寡糖、氨基酸等小分子营养物质，增强黑木耳的营养活性和生物利用度[16]，提高传统米酒的营养价值及保健功效，为黑木耳的深精加工及功能性食品的开发提供新的途径，增强黑木耳在国内及国际市场上的影响力，对于推介吉林省优质特色资源、规划黑木耳种植等方面具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
野生山木耳：吉林省长白山地区；糯米：市售；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。
1.2 仪器与设备
LB50T手持糖度计：深圳市德优平科技有限公司；SPM-808智能生化培养箱：宁波江南仪器厂；HH-8 型恒温水浴锅：苏州江东精密仪器有限公司；Alcomat Super酒精度测试仪：意大利盖博分析仪器公司；FA系列电子分析天平：天津市精拓仪器科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黑木耳米酒酿造工艺流程及操作要点
黑木耳干粉制备：挑选优质干黑木耳于30～40 ℃水中浸泡50～60 min，加水量以淹没黑木耳为宜，清洗干净后将其捞出，加适量水后用组织捣碎机破碎，取出浆液用胶体磨进行细磨，用150、200目的两层纱布过滤、置于105 ℃烘箱干燥24 h，得黑木耳干粉。
浸米、蒸煮、淋米、拌曲：糯米洗净加水浸泡，米和水的料液比为1.0∶2.0（g∶mL），浸泡达米粒无白心，手捏即碎为宜。用水冲去白浆放入锅内进行蒸饭，蒸煮约45 min后待米粒疏松，透明发亮后取出，用约20 ℃的凉水淋至室温，将米饭置于缸内，加甜酒曲与黑木耳干粉后搅拌均匀，中央挖出一个倒喇叭状的小孔，便于观察产酒情况。
糖化发酵：26～34 ℃糖化发酵培养，培养24～72 h结束发酵。
灭菌：将米酒用发酵罐密封加热至75 ℃左右杀菌15～20 min，冷却后即制黑木耳米酒。
1.3.2 单因素试验方法
每次试验投入300 g糯米，以感官评价为指标，分别考察黑木耳添加量（2%、4%、6%、8%、12%）、甜酒曲接种量（0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、发酵时间（32 h、40 h、48 h、56 h、64 h）4个因素对米酒理化指标及感官评分的影响。通过控制变量法进行单因素试验，分别选取固定参数为黑木耳添加量8%，甜酒曲接种量1%，发酵温度30 ℃，发酵时间48 h。
1.3.3 黑木耳米酒酿造工艺优化
在单因素试验的基础上，利用Design Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合试验设计，通过响应面法对黑木耳添加量（A）、甜酒曲接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）为考察因素，依据单因素试验确定的中心值确定其试验水平，以感官评分为响应值，得到最佳酿造工艺，响应面试验因素与水平如表1[17-18]。
表1 黑木耳米酒酿造工艺条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing technology optimization of Auricularia auricula rice wine
1.3.4 测定方法
感官评价方法：由食品营养与检测专业12名学生组成感官评价小组，其中6男6女，参照农业行业标准NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》对评价小组成员进行专业培训，产出成品当天即进行独立品评赋分，样品随机编号，计算平均值。具体评价标准见表2[19-20]。
表2 黑木耳米酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standard of Auricularia auricula rice wine
酒精度：参照GB/T 5009.225—2016《酒中乙醇浓度的测定》；还原糖：参照GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》；总酸：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；氨基酸：参照GB5009.124—2016《食品中氨基酸的测定；菌落总数：参照GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》；大肠菌群：参照GB/T 4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 黑木耳添加量对米酒品质的影响
由图1可知，随着黑木耳添加量的增加，黑木耳米酒感官评分呈现先升高后降低的趋势，酒精度起初稍有升高，添加量＞6%时开始下降。黑木耳添加量较少时，米酒中黑木耳味道极淡，色泽较浅，有涩味，随着黑木耳添加量的增加，米酒色泽逐渐变深呈褐色，口感爽滑，有黑木耳清香味道，酒体协调性好；黑木耳添加量为6%时，黑木耳米酒的感官评分达到了（89.1±1.5）分；黑木耳添加量超过6%时，由于黑木耳添加比例过大，相当于拌曲加水量减少，影响后续酵母发酵产酒精，酒精度下降，米酒风味下降，产品口感黏稠，有腻口感，酒体呈现微浑，协调性差。因此选择黑木耳添加量为4%、6%、8%用于响应面优化试验。
图1 黑木耳添加量对黑木耳米酒酒精度及感官评分的影响
Fig.1 Effect of Auricularia auricula addition on alcohol content and sensory evaluation of A.auricula rice wine
不相同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.1.2 甜酒曲接种量对米酒品质的影响
图2 甜酒曲接种量对黑木耳米酒酒精度及感官评分的影响
Fig.2 Effect of sweet Jiuqu inoculum on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine
由图2可知，接种量为0.4～1.0%时，随着甜酒曲接种量的增加，酒精度随之增加，当接种量偏低时甜酒曲中根霉及酵母菌生长及糖化作用较低，原料不能完全发酵，导致米酒中酒精度偏低，酒香不突出，口感偏淡无味，随着甜酒曲接种量增加，发酵速度加快，酒精度持续增加；当接种量为1.0%时，米酒香气浓郁，口感爽滑细腻，味道协调柔和，此时感官评分最高为（90±1.4）分；而当接种量超过1.0%时，由于甜酒曲中根霉菌及酵母菌大量繁殖导致发酵体系急剧升温，酵母菌中大量有害菌繁殖，引起酸败现象，影响米酒澄清度，酒体风味变得酸涩、泛苦，感官评分随之下降。因此，选择甜酒曲接种量为0.8%、1.0%、1.2%用于响应面优化试验。
2.1.3 发酵温度对米酒品质的影响
图3 发酵温度对黑木耳米酒酒精度及感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine
由图3可知，随着发酵温度的升高，米酒的酒精度呈现升高的趋势，感官评分呈现先升高后下降的趋势，当温度较低时，甜酒曲中根霉及酵母菌的生长及糖化发酵作用较低，原料利用率低，酒体浑浊，米酒口感寡淡无味，当温度达到30 ℃，酒曲中的根霉达到最适宜发酵温度，根霉利用其淀粉酶活性可以将糯米淀粉及黑木耳中的高分子营养成分分解成单糖、低聚糖等，同时自身发酵产生乳酸等有机酸，形成黑木耳独有的清香及米酒香气，口感爽滑、柔和，黑木耳米酒的感官评分达到了（88±1.5）分；温度高于30 ℃，容易滋生微生物，同时随着发酵速度加快会产生一系列副产物导致酒体变浑浊，有异味产生，酒体不协调，黑木耳米酒的感官评分下降。因此选择发酵温度为28 ℃、30 ℃、32 ℃用于响应面优化试验。
2.1.4 发酵时间对米酒品质的影响
图4 发酵时间对黑木耳米酒酒精度及感官评分的影响
Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content and sensory evaluation of Auricularia auricula rice wine
由图4可知，随着发酵时间延长，黑木耳米酒感官评分呈现先升高后降低的趋势，酒精度持续升高。发酵时间较短，则糖化不完全，发酵液中还原糖含量及酒精度均较低，风味不显著；随着发酵时间延长，发酵液酒精中糖分不断转换成乙醇和香气物质，导致感官评分分数偏高，黑木耳米酒的感官评分达到了（87±1.4）分；发酵时间超过48 h，酒精度明显升高，同时产生大量乙酸，酒体中酸味较重，酒味大，米酒有强烈的苦涩味，口感差，黑木耳米酒的感官评分下降。因此选择40 h、48 h、56 h用于响应面优化试验。
2.2 响应面试验
在单因素试验的基础上，通过响应面试验对黑木耳添加量（A）、甜酒曲接种量（B）、发酵温度（C）、发酵时间（D）4个因素分析，试验设计及结果见表3，方差分析见表4。
表3 黑木耳米酒酿造工艺条件优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and results of response surface tests for brewing technology optimization of Auricularia auricula rice wine
表4 响应面试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface tests results
将试验数据通过Design Expert 8.0软件进行多元回归拟合，得到4个因素的多元回归方程：
由表4数据可知，模型P＜0.000 1（极显著），失拟项P=0.285 6＞0.05（不显著），说明试验模型有较好的拟合性，相关系数R2=0.966 7和调整系数R2Adj=0.955 3也表明模型拟合程度较好。4.85%的变异系数（CV）说明模型的重现性很好。可以利用回归方程确定黑木耳米酒酿造工艺条件。
显著性检验表明，对黑木耳米酒感官评分影响次序为：C（发酵温度）＞B（接种量）＞D（发酵时间）＞A（添加量），与表3的方差分析结果吻合。其中一次项B、C、D及交互项BD二次项A2、C2、D2对米酒感官评分的影响极显著（P＜0.01）；一次项A及交互项AB、AC、AD对米酒感官评分的影响显著（0.01＜P＜0.05）；其他因素对感官评分的影响不显著（P＞0.05）。
图5 黑木耳添加量、酒曲接种量、发酵温度、发酵时间交互作用对黑木耳米酒感官评分影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Auricularia auricula addition,sweet Jiuqu inoculum,fermentation temperature and time on the sensory evaluation of A.auricula rice wine
由图5可以直观看出各因素的交互作用对米酒感官品质的影响，若曲线越陡峭则该因素对米酒感官评分的影响越大。由图5可以看出发酵温度（C）对米酒感官品质影响最大，甜酒曲接种量（B）次之，与表4的方差分析结果相吻合。
2.3 优化条件的确定和模型验证
通过软件分析确定黑木耳米酒最佳酿造工艺为黑木耳添加量6.18%、甜酒曲接种量0.97%、发酵温度29.50 ℃、发酵时间47.54 h，黑木耳米酒感官评分由公式计算出理论值为91.43分。为方便实际操作，调整黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接种量为1.0%，发酵温度为30 ℃，发酵时间47.5 h，得到黑木耳米酒的感官评分为91.6分，实测值与预测值相对误差为0.19%，测定结果稳定，表明该试验结果具有一定的参考价值。
2.4 理化及微生物指标分析
在黑木耳米酒最佳酿造工艺条件下测定酒精度为9.75%vol；总酸（以乳酸计）为0.78 g/100 g，这两项理化指标均符合中华人民共和国NY/T1885—2010质量标准。黑木耳米酒中微生物菌落总数29 CFU/g；大肠菌群1.58 MPN/g，未检出其他致病菌，检测结果符合中国农业行业标准NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》对米酒中微生物的限量要求。针对糯米发酵制备米酒与黑木耳与糯米混合发酵制备米酒进行游离氨基酸与还原糖含量对比试验，结果表明，混合发酵黑木耳米酒中氨基酸及还原糖含量分别为4.54 g/100 g以及10.73 g/100 g增加率分别为63.95%和60.96%，经分析可知，黑木耳在发酵过程中利用甜酒曲中的蛋白酶和糖化酶在体外将黑木耳中大分子蛋白及多糖分解成易吸收小分子的氨基酸和寡糖等成分，可促使黑木耳的保健功效在人体内发挥得更好。
3 结论
根据所建立的响应面模型，以感官评分为评价指标，确定最佳酿造工艺条件为：黑木耳添加量6.2%、甜酒曲接种量为1.0%、发酵温度30 ℃、发酵时间47.5 h，采用此工艺酿造的黑木耳米酒的感官评分为91.6分，其中还原糖及氨基酸理化指标较单独发酵米酒增加率超过60%，卫生指标符合国家安全标准。黑木耳米酒汤色呈现褐色，有黑木耳清香及米酒香气，味道协调柔和，酒体丰满协调，有黑木耳米酒独特的风格，产品兼具营养保健功效，不仅丰富了黑木耳发酵食品系列，提高黑木耳的利用率，还为开发新型发酵酒饮品提供研究方向。
[1]陈雪凤，韦仕岩，吴圣进，等.不同黑木耳菌株的营养成分分析比较[J].食用菌，2016，38（2）：72-73.
[2]张琳.木耳的化学成分及药理作用研究[D].长春：吉林农业大学，2013.
[3]李时珍.本草纲目[M].倪泰一，李智谋译.南京：江苏人民出版社，2011：53-56.
[4]张彦龙，穆跃，李元敬，等.地理环境和基因型对黑木耳营养组成和品质结构的影响[J].食品科学，2018，39（2）：234-235.
[5]陈龙，李文峰，令博，等.金耳、银耳、木耳多酚提取及其抗氧化活性[J].食品科学，2011，32（20）：52-56.
[6]张丕奇，张介弛，刘佳宁，等.黑木耳富集沙棘黄酮栽培效果研究[J].中国食用菌，2010，29（5）：25-27.
[7]ZOU Y,XIE C,FAN G,et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction of melanin from Auricularia auricula fruit bodies[J].Innov Food Sci Emer Tech,2010,11(4):611-615.
[8]付娆.纤维素酶法制备黑木耳残渣中的膳食纤维及性质测定[D].哈尔滨：东北农业大学，2014.
[9]邹宇，尹冬梅，冮洁，等.黑木耳黑色素组分分析及其抗氧化活性研究[J].食品科学，2013，34（23）：138-141.
[10]甘霓，吴小勇，郑传进，等.黑木耳多糖对B16 黑色瘤细胞抗肿瘤作用研究[J].广东药科大学学报，2017，33（6）：758-762.
[11]LI B,LI W,CHEN X,et al. In vitro antibiofilm activity of the melanin from Auricularia auricula,an edible jelly mushroom[J].Ann Microbiol,2012,62(4):1523-1530.
[12]尹红力，赵鑫，佟丽，等.黑木耳多糖体外和体内降血糖功能[J].营养卫生，2015，36（21）：221-226.
[13]王波，马琪，麻鑫，等.黑木耳多糖提取物对肝纤维化大鼠肝功能及MPO，MDA，TGF-β 的影响[J].现代生物医学进展，2016，16（19）：3638-3640.
[14]王翠菊，刘贵波，孙成，等.木耳多糖影响家兔动脉粥样硬化斑块中基质金属蛋白酶-13 表达的研究[J].中国药物与临床，2007，7（5）：355-357.
[15]李德海，史锦硕，周聪，等.黑木耳多糖的制备及其抗凝血功能的研究[J].安徽农业科学，2015，34（2）：283-285.
[16]王倩，吴梦兰，郑硕，等.酶解黑木耳饮料制备工艺的研究[J].食品研究与开发，2018，39（24）：71-76.
[17]赵翾，刘功良，李红良，等.响应面法优化香梨米酒的发酵工艺研究[J].中国酿造，2017，36（10）：186-189.
[18]刘琨毅，王琪，冯雨辰，等.响应面法优化黑豆米酒发酵工艺[J].中国酿造，2017，37（2）：179-183.
[19]黄壹杨，刘琨毅，王琪，等.基于响应面法优化红豆米酒发酵工艺的研究[J].食品与发酵工业，2018，44（5）：130-134.
[20]蔡勇，王然.红菇娘米酒的酿造工艺研究[J].中国酿造，2018，37（8）：192-197.