酱油是人们日常生活中重要的调味品，近年来随着酱油生产企业不断扩大市场和物流业的快速发展，各地区都有来自全国各地的酱油供消费者选择。由于各地生活习惯和对食品的口味要求不同，作为发酵调味品的酱油有一定的地域性。虽然生产酱油可以采用不同的生产工艺，但是得到的酱油在香气特征方面都具有一定的相似性。由于酱油的香气品质好与坏是衡量其质量的重要指标，所以很多学者研究过酱油的香气。日本早在1887年就开始研究酱油的香气[1]，我国在1953年就有了报道酱油香气成分的文献[2]。早期对酱油香气的分析主要是分析其中的挥发性成分，从酱油中鉴定出的挥发性成分已经超过300种[3]，然而并不是每种挥发性成分都对酱油的香气有贡献。
从2004年开始有文献报道结合人的嗅觉来研究酱油的香气成分[4]，也就是通过气相色谱-嗅闻仪联用（gas chromatography-olfactometry，GC-O）从提取物中鉴定出能够被人的嗅觉感知到的香气活性成分（odor-active compound，OAC），进而从中确定出对香气真正有贡献的关键香气成分（key odorants，KO）。BAEK H H等[4]利用GC-O从酱油的提取物中鉴定出了11种香气活性成分，其中3-甲硫基丙醛、呋喃酮和酱油酮对酱油的香气比较重要。SCHIEBERLE P等[5]首次采用分子感官科学的方法研究了日本酱油中的香气成分，鉴定出30种OACs，通过稳定同位素稀释分析法进行定量，计算香气活性值（odor activity value，OAV），筛选出了13种日本酱油中的KO。国内从2009年开始采用GC-O分析酱的香气成分，从中鉴定出了26种OACs[6]。自2010年以后关于酱油香气成分的英文文献多数结合了人的嗅闻，而中文文献还多数只是进行气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。分析酱油香气的目的是确定出酱油中的KO，目前从酱油中已经鉴定出来的KO有30多种[5，7-9]。
分析酱油中香气成分时首先需要将香气成分从酱油中提取出来，可以采用的方法有溶剂萃取[10]、水蒸气蒸馏[11]、吹扫捕集[12]、同时蒸馏萃取[13]、固相微萃取[14]、溶剂萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发（solvent extraction-solvent assistant flavor evaporation，SE-SAFE）[5]；在这些方法中，由于SE-SAFE采用温度低、高真空系统和液氮冷凝，得到的提取物的香气最接近样品的实际香气（水蒸气蒸馏法和同时蒸馏萃取法需要对样品进行加热，会生成一些样品中不存在的成分；溶剂萃取法得到的提取物中会含有一些不挥发和难挥发性成分，直接进行分析对分析仪器不利；固相微萃取法中起到萃取作用的萃取纤维对挥发性成分具有一定的选择性；吹扫捕集法吹扫效率受到多重因素的影响，如吹扫温度、吹扫气的流速、吹扫时间、捕集效率等），本研究采用SE-SAFE的方法提取市售同级别不同产地的高盐稀态酿造酱油中的挥发性成分，利用气相色谱-质谱-嗅闻联用（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GC-MS-O）的方法鉴别其中的KOs，探讨同级别酱油之间KOs是否有差别，为鉴别不同级别的酱油和制定相关标准提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三个酱油样品都为特级高盐稀态酿造酱油，样品1所用原料有水、非转基因大豆、食用盐、小麦、酵母抽提物，生产日期为2017-12-05；样品2所用原料有水、非转基因脱脂大豆、小麦、食用盐、白砂糖、谷氨酸钠、5'-呈味核苷酸二钠、酵母抽提物、三氯蔗糖，生产日期为2018-03-07；样品3所用原料有水、非转基因黄豆、小麦、食用盐、白砂糖、酵母抽提物，生产日期为2018-02-05。
4-乙基愈创木酚（纯度98%）、异丁醇（纯度99%）、甲基环戊烯醇酮（纯度99%）、正丁醇（纯度99.5%）、愈创木酚（纯度99%）、异戊醇（纯度99%）、羟基丙酮（纯度92%）、2,6-二甲基吡嗪（纯度98%）、2,5-二甲基吡嗪（纯度99%）、乳酸乙酯（纯度98%）、2,3,5-三甲基吡嗪（纯度98%）、乙酸（纯度99.8%）、2-乙酰基呋喃（纯度98%）、3-甲硫基丙醛（纯度95%）、丙酸（纯度99%）、3-甲硫基丙醇（纯度98%）、2（5H）-呋喃酮（纯度96%）、4-甲基戊酸（纯度99%）、苯乙醇（纯度99%）、2-乙酰基吡咯（纯度98%）、丁酸（纯度99%）、2-辛醇（纯度99%）、麦芽酚（纯度99%）：北京百灵威科技有限公司；异丁酸（纯度99%）：紫晶化学科技有限公司；4-乙基苯酚（纯度＞97%）、苯甲酸（纯度＞99.0%）、苯甲醛（纯度＞98%）、糠醇（纯度＞98%）、乙基环戊烯醇酮（纯度＞97%）、3-甲基丁酸（纯度98%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；酱油酮（纯度95%）、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（纯度99%）、1-羟基-2-丁酮（纯度＞96%），北京华威锐科化工有限公司；苯乙醛（纯度95%），上海麦克林生化科技有限公司；呋喃酮（纯度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；苯乙酸（纯度95%）：英国Key Organics公司；乙偶姻（纯度97%）、2-乙基-5（6）-甲基吡嗪（纯度＞98%）：（北京）阿达玛斯试剂有限公司；C7～C28正构烷烃（色谱纯）：美国Supelco公司；无水硫酸钠（分析纯）、二氯甲烷（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
7890B气相色谱-5977A质谱联用仪：美国安捷仑公司；sniffer3000嗅闻仪：德国Gerstel公司；高真空泵组：英国EDWARDS公司；蝶形玻璃仪器：莘县京兴玻璃器皿有限公司；DKB-501A型超级恒温水槽：上海森信实验仪器有限公司；BF-2000氮气吹干仪：北京八方世纪科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品处理方法
将酱油100 mL和二氯甲烷50 mL放入玻璃瓶中，在室温条件下用摇床振荡1 h，然后将酱油和二氯甲烷分离，得到萃取液（A）和酱油；把分离出的酱油加入玻璃瓶中，再加入二氯甲烷50 mL，重复以上操作，得到萃取液（B），共萃取3次，得到萃取液A、B、C，合并萃取液。使用SAFE将所得萃取液中的挥发性成分与难挥发性成分分离；加热端水浴温度为40 ℃，收集馏分一侧用液氮冷却，采用的压力应低于2.5×10-5 mbar，用无水硫酸钠对收集到的挥发性馏分进行干燥过夜。过滤得到滤液，用韦氏蒸馏柱浓缩至3 mL左右，用氮吹进一步浓缩至1 mL，采用GC-MS-O对所得浓缩物进行分析。
1.3.2 GC-MS-O分析条件
气相色谱（GC）条件：选用DB-WAX（30.0 m×250 μm×0.25 μm）型毛细管色谱柱；色谱柱起始温度为40 ℃，在该温度下保持2 min，之后采用三阶程序升温，第一阶以8 ℃/min的速率升至80 ℃，第二阶是在80 ℃以4 ℃/min的速率升至100 ℃，第三阶是在100 ℃以6 ℃/min的速率升至230 ℃，最后在230 ℃保持5 min；使用氦气（He）作载气，其流量为1.66 mL/min；进样口温度250 ℃，传输线的温度是250 ℃。
质谱（MS）条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源采用的温度为230 ℃，四极杆温度设定为150 ℃，Scan模式进行扫描，扫描范围为33～350 m/z。
嗅闻（O）条件：经GC分离出成分在色谱柱的末端，以1∶2的比例分别进入MS和O，嗅闻口温度为220 ℃，采用不分流模式进样，量为1 μL。嗅闻实验由3名经过训练人员进行（实验前需要进行至少20 h的嗅闻培训），评价人员在嗅闻口嗅闻流出的香气，记录香气特征和保留时间，每个样品每位嗅闻人员嗅闻2～3次，2人以上能嗅闻到的香气给予报道。
1.3.3 定性定量方法
定性分析：通过香气特征、质谱和保留指数对嗅闻到的香气成分进行初步定性，然后再分析确定出的成分的标准品，如果香气特征、质谱和保留指数（retention index，RI）与嗅闻到的成分的一致，则给予报道；如果不一致，不予报道。
定量分析：以2-辛醇为内标（1×105 μg/L），采用内标法进行定量。由于质谱作为检测器对每种成分的响应不同，为了定量结果相对准确，测定了被定量成分与内标2-辛醇的相对校正因子。取相同质量的被定量成分与2-辛醇，用GC-MS-O分析，得到各自的峰面积，则被定量成分与2-辛醇的相对校正因子f可按照下式进行计算：
式中：f表示被定量成分对内标2-辛醇的相对校正因子；f内表示内标的校正因子，S内表示相同质量下内标2-辛醇的峰面积；fx表示被定量成分的校正因子，Sx表示相同质量下被定量成分的峰面积。
被定量成分在样品中的质量浓度（C）可按照下式计算：
式中：f表示被定量成分对内标2-辛醇的相对校正因子；S1表示被定量成分的峰面积；m表示的是样品中添加的内标2-辛醇的质量，30 μg；V表示酱油样品提取液浓缩的体积，1 mL；S2表示内标2-辛醇的峰面积。
1.3.4 OAV的计算方法
OAV即为OACs在酱油中的浓度与其自身阈值的比值；OAV＞1的OACs对酱油的香气轮廓贡献大，被确定为酱油的KOs。
2 结果与分析
2.1 三个酱油样品中鉴定出的香气活性物质
通过SE-SAFE的方法将三个酱油样品中的挥发性成分提取出来，利用GC-MS-O对提取物进行分析，所得三个酱油样品GC-MS分析总离子流色谱谱图见图1。对嗅闻到的香气活性区域进行定性，从3个酱油样品中共定性出37种香气活性成分，所得结果见表1。
图1 三个酱油样品中挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in 3 kinds of soy sauce samples analysis by GC-MS
表1 三种酱油样品中香气活性成分鉴定结果
Table 1 Identification results of odor active components in 3 kinds of soy sauce samples
续表
续表
注：“+”表示在样品中鉴定出来，“-”表示在样品中没有鉴定出来；O表示香气特征，MS表示质谱，RI表示保留指数，S表示标准品。
由表1可知，从3种酱油中共鉴定出香气活性成分37种，其中样品1中共鉴定出32种，样品2中共鉴定出35种，样品3中共鉴定出30种，3个样品中共有的香气活性成分有26种。在37种香气活性成分中醇类有6种、酸类8种、醛类3种、酮类10种、吡嗪类5种、酚类3种、其他2种。
鉴定出的6种醇类香气活性物质中包括异丁醇、正丁醇、异戊醇、糠醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇，它们多数都属于杂醇油的成分，它们是生产酱油过程中所使用的酵母代谢产生的，一般认为有两种生成途径：一种是酵母以氨基酸为基质的降解代谢途径，如亮氨酸经过降解后变成异戊醇，缬氨酸降解后变成异丁醇等；一种是酵母以糖为基质的合成代谢途径，酵母利用糖通过酮酸路线合成氨基酸，进而合成自身细胞蛋白，其中间体可在α-酮酸酶的作用下经脱羧、脱氢生成相应醇[15]。鉴定出的8种酸类香气活性物质中包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、3-甲基丁酸、4-甲基戊酸、苯甲酸、苯乙酸，它们在酱油中都曾以挥发性成分被鉴定出来[16]，它们可由游离氨基酸经乳酸菌代谢产生，如甘氨酸产生乙酸、丙氨酸产生丙酸、亮氨酸产生3-甲基丁酸和4-甲基戊酸、缬氨酸产生异丁酸；苯甲酸可由Leuconostoc属的乳酸菌利用苯丙氨酸产生[17]，它也可能是生产厂家添加的，因为它是我国允许使用的防腐剂，在酱油中的最大用量是1 g/kg；另外在葡萄糖存在下，加热L-苯丙氨酸可以得到苯乙酸，加热L-亮氨酸可以得到3-甲基丁酸[18]。鉴定出醛类香气活性物质有3种，分别是3-甲硫基丙醛、苯甲醛、苯乙醛，其中3-甲硫基丙醛和苯乙醛可通过Strecker降解产生，也可以通过酵母的Ehrlich代谢途径产生，它们的前体物是蛋氨酸和苯丙氨酸[16]；苯甲醛可由乳酸菌通过代谢产生，其前体物也是苯丙氨酸[17]。鉴定出的10种酮类香气活性物质中有乙偶姻、羟基丙酮、1-羟基-2-丁酮、2-乙酰基呋喃、2（5H）-呋喃酮、甲基环戊烯醇酮、乙基环戊烯醇酮、麦芽酚（3-羟基-2-甲基-4-吡喃酮）、呋喃酮、酱油酮，呋喃酮类物质（如呋喃酮、酱油）即通过还原糖与氨基酸通过美拉德反应产生[19]，也可以通过微生物代谢产生[20]；乙偶姻、1-羟基-2-丁酮、甲基环戊啊烯醇酮和乙基环戊烯醇酮都可通过戊糖与β-丙氨酰组氨酸反应生成[21]。鉴定出来的5种吡嗪类物质分别是2,6-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，主要通过美拉德反应生成[22]。鉴定出来的3种酚类物质是愈创木酚、4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚，它们可通过代谢产生[23]，也可以通过酚酸类物质受热分解产生[24]。两种其他香气活性物质是乳酸乙酯和2-乙酰基吡咯，乳酸乙酯是乳酸菌发酵产生的乳酸与酵母菌发酵产生的乙醇酯化后产生的；2-乙酰基吡咯在日本酱油中被鉴定出来，并且其含量在储存过程显著升高[25]。
2.2 三个酱油样品中鉴定出的香气活性物质的定量结果
为了对比三个不同厂家的特级高盐稀态酿造酱油中香气活性物质的含量，采用内标法对香气活性物质进行了定量，所得结果见表2。
表2 三种酱油样品中香气活性成分定量结果
Table 2 Quantitative results of odor active components in 3 kinds of soy sauce samples
续表
由表2可知，三个样品中香气活性物质的总含量有一定差别，也就是说即使都为同一级别的酱油，它们所含香气活性成分也是不同的，其中样品1中的香气活性物质含量最高（达到118 097.98 μg/L），样品2中的香气活性物质含量最低（达到87 098.41 μg/L）；并且三个样品中各类香气活性成分的含量也有所不同，这应该是导致三个样品之间香气有所不同的主要原因。在三个样品中醇类香气物质的总含量接近，尤其是样品1与样品2（其中样品1中醇类成分总含量为14 196.44 μg/L，样品2中醇类成分含量为14 539.71 μg/L），样品3中糠醇的含量较高，使得样品3中总醇含量略高；糠醇具有温和的焦香，它使得样品3的焦香略强。三个样品中酸类香气成分含量有所不同，其中样品1中酸类物质含量较高（为60 035.52 μg/L），样品3中酸类物质含量较低（为43 043.75 μg/L）；这些酸类成分中苯乙酸赋予酱油蜜甜香气，其他酸类成分赋予酱油酸香，其中乙酸可以起到头香的作用，所以在三个样品中由于样品1和样品2的乙酸含量较高，它们的香气更透发。三个样品中醛类物质的含量差别较大，其中样品3中醛类物质含量最高，醛类物质中又以3-甲硫基丙醛的含量最高（为样品2的1.5倍，样品1的2.6倍），由于3-甲硫基丙醛是构成酱香的特征成分，它使得样品3的煮土豆的香气强度较大。酮类香气活性成分在样品1中的含量最高（为28 659.90 μg/L，为样品2的2.3倍，样品3的1.3倍），在样品2中的含量最低（为12 245.03 μg/L），酮类物质中以麦芽酚和酱油酮的含量主，它们具有典型的焦糖香，这也是样品1的焦糖香气强度最大的原因。三个样品中吡嗪类物质的含量差别较大，其中样品1中含量最低，样品2中含量最高（为样品1的4.8倍，为样品3的1.9倍），这类物质赋予了酱油一定的坚果香。酚类物质在3个样品中含量有一定的差别，样品3中含量较低（1 148.67 μg/L），样品2中含量较高（2 309.52 μg/L，为样品3的2倍），酚类赋予酱油烟熏的香气；采用评香条蘸取酱油，对它们的香气进行评价时，明显能够感觉到样品3的体香和尾香中烟熏气息较弱，焦甜气息更突出。
三个相同级别的酱油在香气活性物质种类上的差别与香气活性物质的含量上的不同可能与它们所用原料及生产工艺有关。在原料上，三个样品都使用了水、非转基因大豆、食用盐、小麦、酵母抽提物，其中小麦中的淀粉与麸皮[10]、大豆的种类都会影响酱油的香气质量[26]；酵母抽提物中含有多种香气成分[27]，它的香气质量与用量多少也与酱油的香气有关系。在生产工艺方面，所用微生物的种类、发酵时间长短[28]、加热杀菌时间的长短都会影响酱油的香气[5，24，28]。由于三个样品来自不同厂家，每个厂家所用原料与生产工艺上的差别可能是导致三个酱油样品香气不同的主要原因。
2.3 三个酱油样品中鉴定出的香气活性物质的香气活性值
表3 三种酱油样品中鉴定出的香气活性成分的香气活性值
Table 3 Odor activity values of identified odor active components in 3 kinds of soy sauce samples
续表
由表3可知，除了4种物质的香气阈值未见文献报道无法计算它们的OAV外，计算了另外33种香气活性物质的OAV，有10种香气成分的OAV＜1，23种香气成分的OAV＞1；这23种香气成分是三种酱油样品中的关键香气成分，对酱油的香气有贡献。OAV＞1的23种香气成分中有15种是三种酱油共有的成分，它们使得三种酱油在香气属性上有相似之处；另外8种非共有的成分，使得它们在香气属性上又有所不同。
样品1中OAV＞1的香气成分有21种，其中OAV＞100的有5种，100＞OAV＞10的有6种，10＞OAV＞1的有10种。样品2中OAV＞1的香气成分有19种，其中OAV＞100的有5种，100＞OAV＞10的有4种，10＞OAV＞1的有10种。样品3中OAV＞1的香气成分有17种，其中OAV＞100的有4种，100＞OAV＞10的有3种，10＞OAV＞1的有10种。在对三个酱油样品进行直接嗅闻时会感觉到样品1的香气特征与香气强度与样品2接近，而样品3与样品1和样品2的香气特征与香气强度存在着明显不同，从OAV的结果可知，样品1和样品2中OAV＞10的香气活性成分在数量和种类上都接近，而与样品3不同；其中在样品1和样品2中OAV＞100的2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，OAV＞50的苯乙醛以及OAV＞1的4-甲基戊酸在样品3中都没有被检测到，使得样品3的整体香气相对单薄，酸香较弱，几乎不能被嗅闻到。
鉴定出来的23种关键香气成分中，值得注意的是酱油酮、3-甲硫基丙醛、异戊醇、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、乙偶姻，它们在酱油中的OAV都＞100，它们对酱油的香气贡献最大。酱油酮的沸点较高，它们属于尾香成分，当采用评香条蘸取酱油嗅闻时，随着头香成分和体香成分的挥发，到最后时三个样品的香气特征接近，都呈现焦糖香。
从表3的结果可以看出，3种同级别酱油中同一关键香气成分的OAV值有的相差较大，如样品1中酱油酮的OAV是样品3中的5倍多，而样品3中3-甲硫基丙醛的OAV是样品1中的3倍多，而现行酱油的标准中只是简单规定特级高盐稀态发酵酱油应具有浓郁的酱香及酯香[30]，不够具体，没有客观的衡量指标，不便于比较同级别酱油在香气方面的差别。
3 结论
采用液液萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发的方法提取了3种市售特级高盐稀态酿造酱油中的挥发性成分，提取物经过GC-MS-O分析，从中共鉴定出37种香气活性物质，其中醇类有6种、酸类8种、醛类3种、酮类10种、吡嗪类5种、酚类3种、其他类2种。
通过对鉴定出的37种香气活性物质进行定量分析和计算它们的香气活性值，23种香气活性成分的OAV≥1，它们是三种酱油样品的关键香气物质；其中15种共有成分（包括酱油酮、3-甲硫基丙醛、异戊醇、乙偶姻、愈创木酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚、3-甲硫基丙醇、麦芽酚、呋喃酮、正丁醇、3-甲基丁酸、苯乙醇、甲基环戊烯醇酮和糠醇）使得三种酱油在香气属性上有相似之处，8种非共有成分（包括2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、苯乙醛、丁酸、羟基丙酮、丙酸、4-甲基戊酸、2-乙基-6-甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪）使得它们在香气属性上又有所不同。
实验结果表明同一级别的酱油在香气活性物质种类和含量上存在差别，关键香气成分也有所不同。为了区别不同级别的酱油，应该制定更具体的评价酱油香气的标准。
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