非花色苷酚是葡萄中的次生代谢产物，对葡萄酒的苦涩味、色泽、贮藏寿命及生物化学稳定性都具有重要作用[1]，并通过辅助成色的作用，可与花色苷一起决定葡萄酒的颜色[2]；研究表明，多酚主要分布于葡萄皮、种子和果梗中，其中果皮是多酚分布种类最多的部位，占葡萄浆果总质量的8%左右[3]。在葡萄成熟过程中非花色苷酚的变化极其复杂，其含量受到葡萄品种、土壤环境、整形方式以及遮光处理等因素的影响[4-7]。葡萄属于喜光植物，对光照具有较高要求，在葡萄生长过程中对光照反应敏感[8]，光照充足果实品质提高、风味突出协调；光照不足引起光合效率降低、果实上色水平降低、果实品质下降[9]；但炎热的气候和过强的光照对葡萄有伤害[10]；倪志婧等[11]研究中发现，采用遮光率为40%遮阳网的处理总酚质量比最高；也有研究证实[12]，光照条件的不同还会引起类黄酮代谢产物的比例发生变化。另外，在果实不同发育阶段进行光照或遮光处理，对果实酚类含量的影响不同。这表明葡萄果实类黄酮代谢对光响应具有发育阶段的依赖性[13]。目前，国内对于非花色苷酚类物质研究的报道还比较少，大部分都集中在花色苷酚类。
新疆长期以来就是我国最主要的葡萄生产地，近年来葡萄种植面积也在不断扩大，但葡萄与葡萄酒质量及风格同质化现象仍较为严重[14]。对于酿造葡萄而言，葡萄质量决定了葡萄酒的先天品质，而对葡萄质量的要求主要体现在果实糖度、糖酸比例和内涵组分上[15]。糖度、糖酸比例是判断葡萄成熟的基本指标，而葡萄的内涵组分是构成葡萄酒多样性的重要因素，只有了解葡萄中的组分构成，才能针对性的改进工艺，提高葡萄酒的品质[16]，目前针对新疆产区所处的地理环境及葡萄酒所面临的问题，有关遮光处理对葡萄非花色苷酚积累影响的研究较少，因此，研究非花色苷酚在葡萄果实成熟过程中的组成特征及变化有利于从非花色苷酚的角度了解葡萄及葡萄酒中的品种特色及产地风格。本实验通过在不同时期对酿酒葡萄进行不同遮光处理，以探究光照强度在不同生长时期对葡萄果实非花色苷酚积累的影响，为提高葡萄果实的质量提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验选取新疆昌吉州榆树沟镇遗韵酒庄种植基地酿酒葡萄赤霞珠为试材，所摘葡萄果实均果粒饱满，大小均匀，采摘时兼顾阴、阳两面和上、中、下果穗及每穗果实的顶、中、尾部。随机选取350粒果实，放置于装有冰袋的泡沫箱中运回。每组样品随机选取50～70粒果实用于理化指标测定，其它用液氮迅速冷冻，并放于-80 ℃冰箱中保存，用作其他检测。
试验设计不同程度的遮光处理，采用两种黑色遮阳网为材料：网1遮光率为50%，网2遮光率为20%。甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（均为色谱纯）：美国Fisher公司；乙酸乙酯（分析纯）：北京化学试剂公司。
1.2 仪器与设备
FD-1A-50台式真空冷冻干燥机：上海比郎仪器制造公司；HZSH型水浴振荡器：上海思蘭达科学仪器有限公司；RE-52AA 型旋转蒸发器：上海星宋科学仪器有限公司；HPLC-MS 液相色谱质谱联用仪：美国Fisher公司；PAL-2手持糖度计：日本ATAGO公司。
1.3 实验方法
1.3.1 遮光处理
分别于果实达到5%转色（花后9周）至完全成熟、100%转色（花后13周）至完全成熟两个时间点，通过水泥柱和铁丝在树体顶端搭建网1及网2进行不同遮光处理，以不搭设遮阳网的植株为对照，搭网后一周（即花后10周、花后14周），以及葡萄果实完全成熟达到采收期时进行样品采集，每个处理设有3个生物学平行。在采收期时，空白样品采摘于9月24日，经过Q1、Q2处理的果实采摘于10月4日，经过H1、H2处理的果实采摘与9月24日，由此可看出在5%转色-完全成熟时期搭建遮光网可延缓果实成熟8～10 d。本实验中5种处理分别为CK：不遮光，果实正常生长（空白对照）；Q1：5%转色至完全成熟期间采用网1遮光；Q2：5%转色至完全成熟期间采用网2遮光；H1：100%转色至完全成熟期间采用网1遮光；H2：100%转色至完全成熟期间采用网2遮光。
1.3.2 果实理化指标检测
可溶性固形物用手持式糖度计进行测定，可滴定酸含量采用酸碱滴定法（以酒石酸计）进行测定，每组样品做2个平行。
1.3.3 非花色苷酚测定方法
葡萄皮中非花色苷酚的提取和定量[17]：葡萄果实经人工剥皮，液氮处理果皮后研磨成粉冷冻干燥。冷冻干燥后称取2 g干粉于离心管中，加入2 mL水及18 mL乙酸乙酯，摇床振荡30 min后，倒出上清液（重复此操作5次），上清液经旋转蒸发后，用色谱级甲醇定容至5 mL，提取液放入-80 ℃冰箱中保存。
葡萄果实中非花色苷酚的检测和定性参考李斯屿等[18]的方法，采用高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatogram-mass spectrum，HPLC-MS）进行测定。
1.3.4 数据处理
使用Microsoft Excel 2013软件进行数据处理；利用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，显著性水平P＜0.05；通过绘图软件Origin Pro 8.5进行绘图。采用MetaboAnalyst进行正交偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）。
2 结果与分析
2.1 果际微气候监测
图1 遮光对果际微气候的影响
Fig.1 Effect of shading on grape fruit micro-climate
实验期间，在对照及两种遮阳网的果穗附近分别架设微型气象站（HOBO H21-002，Onset Corporation，USA），跟踪不同遮光处理以及对照之间果际周围光合有效辐射（photo synthetically active radiation）、太阳总辐射（solar radiation）、大气温度（daily berry temperature）和相对湿度（relative humidity）的变化，结果见图1。由图1可知，遮光后果际周围的光合有效辐射及太阳总辐射均低于对照，其中网1条件下的太阳光合有效辐射减少了大约50%，而网2太阳光合有效辐射减少了大约20%，遮阳网在有效遮光的同时，对果际周围的温度和相对湿度无显著影响。同时于5%转色至完全成熟时进行遮光处理可以推迟果实成熟8～10 d。
2.2 遮光处理对葡萄果实可溶性固形物和可滴定酸含量的影响
表1 遮光处理对葡萄果实可溶性固形物和可滴定酸含量的影响
Table 1 Effects of shading treatments on soluble solids and titratable acid content of grape fruit
由表1可知，葡萄果实在整个生长发育过程中，可溶性固形物含量总体呈现上升趋势。可溶性固形物含量在花后10周至花后14周迅速增长，在花后14周至完全成熟时期增长较为缓慢。在葡萄果实100%转色至完全成熟搭建遮阳网相较于葡萄果实5%转色至完全成熟搭建遮阳网可溶性固形物含量高，经过遮光处理的葡萄果实在整个生长发育过程中可溶性固形物含量均低于对照组。同时葡萄果实可滴定酸含量在所选三个生长发育过程中整体呈现下降趋势，在5%转色至100%转色时迅速下降，降低了76.66%，在完全转色至成熟时期，可滴定酸含量逐渐缓慢下降。经过遮光处理的葡萄果实在整个生长发育过程中可滴定酸含量相较于对照组无明显差异。
2.3 遮光处理对葡萄果实非花色苷酚总量的影响
非花色苷酚类是葡萄果实中除花色苷酚外的一类酚类物质，主要包括酚酸类（苯甲酸类、肉桂酸类）、黄酮醇类（黄烷酮类、黄酮醇类、黄酮类）、黄烷醇类以及芪类等[19]，具有增加颜色强度和稳定颜色的辅色作用[20]，对于葡萄的质量有重要意义。其能产生收敛性和苦味，影响葡萄酒的口感[21]。2016年从昌吉遗韵赤霞珠果皮中共检测17种非花色苷酚，且遮光处理对葡萄果实中的非花色苷酚的构成种类不会有影响。如图2所示，在花后14周时，4种遮光处理的果实中非花色苷酚含量均高于对照组，其中经过Q1、Q2、H1、H2处理的葡萄果实非花色苷酚含量分别为1.14 mg/g、1.43 mg/g、1.39 mg/g、1.82 mg/g。在果实达到采收期时，Q1、Q2、H2处理的葡萄果实非花色苷酚含量显著高于CK，分别提升了18.63%、11.80%、11.80%。同时上述结果表明，遮光处理可显著影响葡萄果实中非花色苷酚的积累（P＜0.05）。
图2 遮光处理对葡萄果实非花色苷酚总量的影响
Fig.2 Effect of shading treatments on the content of non-anthocyanin phenols in grape fruit
不同小写字母表示处理间差异达到显著性水平（P＜0.05），下同。
2.4 遮光处理对葡萄果实黄烷-3-醇类化合物含量的影响
黄烷-3-醇类化合物的单体是为葡萄酒提供苦味和收敛性的重要物质，主要存在于种子中[22]，具有抗氧化作用，降低血压的功效[23]。前人研究表明，儿茶素是黄烷-3-醇类化合物的主要来源[4]，这与本实验所得研究结果一致。不同遮光处理对葡萄果实中黄烷-3-醇类化合物含量的影响见图3。结果表明，经过不同的遮光处理，对葡萄果实中的黄烷-3-醇类化合物含量影响结果不同，在所检测的葡萄果实中，共检测出4种黄烷醇类物质，分别为原花青素B1、没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B2。在所选择的葡萄果实生长周期内，黄烷-3-醇类物质整体呈现在花后14周时上升，在完全成熟时下降的趋势。在花后4周时，采取Q1处理的黄烷-3-醇类物质含量显著高于对照组（P＜0.05），含量可达到0.41 mg/g，增长了1.5倍。其他处理无明显差异（P＞0.05）。在葡萄果实达到完全成熟时，Q1、Q2、H1、H2处理后黄烷-3-醇类化合物含量分别可达到0.33 mg/g、0.17 mg/g、0.21 mg/g、0.20 mg/g。相比于CK有了显著的提升（P＜0.05）。在葡萄生长发育过程中采用遮光处理有利于在果实成熟时提高黄烷-3-醇类物质含量。
图3 遮光处理对葡萄果实黄烷-3-醇类化合物含量的影响
Fig.3 Effects of shading treatments on the content of flavan-3-alcohol in grape fruit
2.5 遮光处理对葡萄果实黄酮醇类化合物含量的影响
对于红色酿酒品种来说，果皮中含有大量的黄酮醇类物质[24]，具有保护葡萄免受紫外线的伤害、消除自由基的功能。图4显示了黄酮醇经过4种遮光处理与对照在所选生长时期的含量变化，黄酮醇类物质含量的变化与本试验可检测到非花色苷酚总量的变化规律相似，这与姜寿梅等[25]在西拉葡萄果实发育过程中的研究结果相似，可看出黄酮类物质是葡萄果实生长发育中最主要的非花色苷酚，其含量高低直接影响总非花色苷酚的变化趋势，黄酮醇物质在所检测的葡萄果实中共检出3类，包括杨梅酮类物质、槲皮素类物质、山萘酚类物质。黄酮醇类物质的含量在花后的不同时期中呈现先下降后上升的变化趋势，在花后14周时，4种遮光处理中，Q2、H1、H2三种处理有提升黄酮醇含量的效果，处理后黄酮醇含量可达到1.24 mg/g、1.20 mg/g、1.66 mg/g。在果实完全成熟达到采收时期，H1处理会抑制黄酮醇类物质的积累。
图4 遮光处理对葡萄果实黄酮醇类化合物含量的影响
Fig.4 Effects of shading treatments on the content of flavonols in grape fruit
2.6 遮光处理对葡萄果实中杨梅酮类化合物含量的影响
图5 遮光处理对葡萄果实杨梅酮类化合物含量的影响
Fig.5 Effects of shading treatments on the content of myricetin in grape fruit
为了探究不同遮光处理对黄酮醇类物质里各组分的影响，对杨梅酮类、槲皮素类及山萘酚类分别进行分析，结果见图5。实验结果表明，杨梅酮类物质在果实5%转色至完全成熟采收时期总体呈现出先降后升的趋势，在花后14周时，Q1、Q2、H1、H2处理均提升了杨酶酮类物质的含量积累，其中未经任何处理的果实杨酶酮含量为0.02 mg/g，经过处理后含量可达到0.06 mg/g、0.30 mg/g、0.34 mg/g、0.40 mg/g，其中，H2处理显著提升了杨梅酮类物质含量的积累（P＜0.05）。
2.7 遮光处理对葡萄果实中槲皮素类化合物含量的影响
槲皮素类物质是非花色苷酚类物质中的一大类物质[26]，占非花色苷酚的60%以上，在果实发育过程中整体呈现下降趋势，在花后14周时，Q2、H1、H2三种处理均可显著提高槲皮素含量（P＜0.05），槲皮素含量为0.86 mg/g、0.79 mg/g、1.11 mg/g，相较与CK含量0.64 mg/g提升了34.37%、23.43%、73.43%，当果实完全成熟时，H1处理会抑制槲皮素类物质的积累。
图6 遮光处理对葡萄果实槲皮素类化合物含量的影响
Fig.6 Effect of shading treatments on quercetin content in grape fruit
2.8 遮光处理对葡萄果实中山萘酚类化合物含量的影响
山萘酚类物质整体呈现缓慢先降后升趋势，在花后14周时，Q2、H2 2种遮光处理的山萘酚含量显著高于CK（P＜0.05），其中H2处理增长幅度较大，Q2处理次之。在葡萄果实完全成熟时期，Q1、Q2、H1、H2 4种遮光处理对于黄酮醇类中的3类物质积累并无显著影响（P＞0.05）。综上所述，不同时期的不同遮光处理对葡萄果实中的3类黄酮醇类物质均有显著影响，并且在完全转色时影响较大。同时，选取遮光率20%的遮阳网（网2）处理效果更加显著。
图7 遮光处理对葡萄果实山萘酚类化合物含量的影响
Fig.7 Effect of shading treatments on the content of kaempferol in grape fruit
2.9 遮光处理对非花色苷酚组分构成的影响
通过偏最小二乘法（PLS-DA）更直观表明不同处理之间非花色苷酚浓度之间的差异，结果见图8。
图8 PLS-DA分析不同遮光处理对非花色苷酚组分的影响
Fig.8 Analysis of the effects of different shading treatments on non-anthocyanin phenols components by PLS-DA
由图8可知，CK处理与其他遮光处理在图中明显分开，说明不同遮光处理方式对非花色苷酚的积累均有影响。4种不同遮光处理的样品均分布在X轴正半轴，对照样品分布在X轴负半轴。由图8A、8B可以看出，Q1、Q2处理可提升没食子儿茶素（gallocatechin）、原花青素B1（procyanin B1）、儿茶素（catechin）、杨梅酮（myricetin）、槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-galactoside）类物质的含量，同时抑制了槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸（quercetin-glucuronide）的含量。图8C、8D展示了H1、H2处理对没食子儿茶素（gallocatechin）、儿茶素（catechin）、原花青素B1（procyanin B1）、原花青素B2（procyanin B2）有提升效果，同时会抑制槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-galactoside）、杨梅酮-3-O-葡萄糖苷（myricetinglucoside）、杨梅酮-3-O-半乳糖苷（myricetin-galactoside）、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-glucoside）的积累。
3 结论
经过4种遮光处理葡萄果实的可溶性固形物含量低于对照组，且经过遮光处理的葡萄果实上调了非花色苷酚的积累。在本实验中，Q1、Q2、H2三种处理均可显著提高非花色苷酚的积累。4种不同遮光处理对黄烷-3-醇类化合物的影响主要集中在葡萄果实完全成熟时期，而相对于黄酮醇来说，花后14周时，4种遮光处理影响了葡萄果实非花色苷酚的积累。运用PLS-DA分析可得到，Q1、Q2处理可提升没食子儿茶素、原花青素B1、儿茶素、杨梅酮、槲皮素-3-O-半乳糖苷类物质的含量，同时抑制了槲皮素-3-O-葡萄糖苷酸的含量。H1、H2处理则对没食子儿茶素、儿茶素、原花青素B1、原花青素B2有提升效果，同时会抑制槲皮素-3-O-半乳糖苷、杨梅酮-3-O-葡萄糖苷、杨梅酮-3-O-半乳糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷的积累。
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